本发明专利技术公开了一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名为101-V，分类命名为：酿酒酵母Saccharomyces?cerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?NO.5758。本发明专利技术还公开了一种构建高产谷胱甘肽工程菌株的方法，是将透明颤菌血红蛋白基因vgb整合到产谷胱甘肽的酵母基因组中，筛选得到能够表达透明颤菌血红蛋白基因的重组酵母，如此，从分子水平上提高了血红蛋白基因重组菌对氧气的利用能力，解决了微生物发酵过程中的氧气供求矛盾，降低了氧气及能量的消耗，并同时提高了谷胱甘肽的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，其构建方法，及其在生产谷胱甘肽中的应用。
技术介绍
谷胱甘肽(glutathione，GSH)又名Y _L_谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的生物活性三肽化合物，广泛存在于动物、植物和微生物细胞中。发酵法因其可以利用廉价的生产原料通过特定的微生物代谢合成谷胱甘肽，操作简单、成本较低且生产速率快而越来越受到青睐(Meister A，Anderson M Ε. Glutathione. Ann Rev Biochem,1983,52 :711-760. Li Y， Wei G Y,Chen J, Glutathione :a review on biotechnological productionAppl MicrobiolBiotechnol，2004，66 (3) :233-242)。GSH的生理功能主要有以下几方面(1)抗自由基对细胞的损伤机体代谢产生的过多自由基会损伤生物膜、侵袭生命大分子、加快机体衰老、诱发肿瘤或动脉硬化的产生。GSH可以通过巯基与体内的自由基结合转化成易代谢的酸性物质，加速自由基的排泄，对细胞起到强有力的保护作用。⑵除外源有毒物质的毒性GSH能与进入机体有毒化合物、重金属离子等直接结合，并促其排出体外，起到中和解毒的作用。临床上已应用GSH来解除丙烯腈、氟化物、C0、重金属、有机溶剂的中毒现象。( 促进细胞合成蛋白质GSH可通过Y-谷氨酰基转运酶直接进入细胞内，并通过Y2谷氨酰基循环参与众多氨基酸的转运，进而促进蛋白质的合成。(4)是多种酶的辅基或辅酶GSH参与三羧酸循环与糖代谢，组织中有许多酶是以GSH为辅酶，其活性需要GSH的存在才能表现出来。另外，GSH对于需要巯基的酶有保护或恢复活性的作用。(5)参与转甲基、转丙氨基反应，维持肝细胞正常功能(刘娟，刘春秀，王雅琴等。发酵法生产谷胱甘肽的研究进展.微生物学通报，2002，四(6) :71-75)。谷胱甘肽的生物合成由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸通过谷氨酰半胱氨酰合成酶(GSH I)和谷胱甘肽合成酶(GSH II)催化的。其中，GSH I是GSH合成中的限速酶，受GSH的反馈抑制。在合成过程中，每合成一分子的谷胱甘肽需要消耗二分子的ATP。另外，GSH也可以在NADPH存在时通过谷胱甘肽还原酶将氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原得到。在微生物界，GSH产生菌主要集中在真核生物和革兰氏阴性菌中。野生型酿酒酵母和产朊假丝酵母本身具有较高的GSH含量(占细胞干重的0. 1.0% )，并且能够持续保持GSH的合成能力，因此它们已成为工业生产谷胱甘肽最常用的菌种。在实际发酵生产中，GSH产量的提高可以通过两个方面来实现一是菌体本身细胞内GSH含量的提高；二是通过提高菌体生物量使GSH的总量提高。工业发酵的最终目标是以最低的生产成本获得最大的产值和收益，而实现这一目标的手段就是针对每个特定过程建立相应的高效发酵模式。GSH的发酵过程可以分为两个阶段细胞生长阶段和GSH的合成阶段。所以，GSH总量的增加可以分别在这两个阶段通过增加细胞的生物量或者细胞内GSH的合成量来实现。而对发酵过程的控制可以同时从这两个方面使GSH的总量提高。目前，通过补料分批培养实现高密度发酵是增加细胞生物量的最成熟和最完善的方法。但是，在实际发酵过程中，由于溶氧、副产物积累等因素影响了细胞的生长，从而难以实现高密度发酵。因此，解决供氧问题是获得大量目的产物的关键之一。传统的解决办法是改善设备的供氧能力，提高搅拌速度，增大通气量，以增加空气在培养液中的截留率，增加气液相接触的比表面积；或者在培养液中加入某些助溶剂，以提高氧的溶解度。所有这些方法均受到设备和能耗的限制，现在仅用于通气和搅拌的能耗已占整个发酵成本的1/3，严重限制了发酵工业的发展。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，简称为VHb)是原核生物中迄今发现的唯一的一种血红蛋白，能够从分子水平上提高透明颤菌血红蛋白基因(vgb)重组菌对氧气的利用能力，因此能在限氧条件下促进细胞生长和产物合成，从而大幅度提高发酵过程中目的产物的产量和收率。VHb的应用不仅可以降低氧气及能量的消耗，还不需要附加的设备投资，因此可大大降低发酵成本。可以说，VHb的发现及研究进展为利用分子克隆技术解决微生物发酵过程中的氧气供求矛盾及实现高密度发酵培养提供了良好途径，因此VHb的研究与应用必将成为发酵工业中的一项关键技术，具有十分光明的前景。酿酒酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又具有真核生物能够对蛋白质进行翻译后修饰的的优点。酿酒酵母表达系统表达外源基因的优点有很多酿酒酵母培养条件普通，生长繁殖迅速，用于表达基因工程产品时工艺简单，能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产，有效降低生产成本，已广泛应用于酿酒和食品工业；它不会产生毒素，安全可靠；酿酒酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，特别适合于表达真核生物基因，有利于保持生物产品的活性和稳定性(唐香山，张学文。酿酒酵母表达系统.生命科学研究，2004，8 (2)106-109)。VHb已成功的用于提高多种微生物中目的产物的产量，但至今没有利用VHb提高酿酒酵母菌发酵生产谷胱甘肽产量的报道。将VHb应用于酿酒酵母表达系统中，有望解决酿酒酵母高密度发酵中供氧不足的问题，进而提高谷胱甘肽在酿酒酵母中的产量。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，其构建方法，及其在生产谷胱甘肽中的应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的一株产谷胱甘肽的酵母工程菌，菌株名为101-V，分类命名为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 5758。一种产谷胱甘肽的酵母工程菌的构建方法，是将透明颤菌血红蛋白基因Vgb整合到产谷胱甘肽的酵母基因组中，筛选得到能够表达透明颤菌血红蛋白基因的重组酵母，其中，透明颤菌血红蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示，为GenBank号为M27061的5'-端第142-582位核苷酸序列。所述用于将透明颤菌血红蛋白基因Vgb整合到酵母基因组中使用的重组载体是pYM-vgb,该载体是将透明颤菌血红蛋白基因vgb连接到质粒pYMIKP (本实验室保存，图谱参照说明书附图1所示。刘向勇，沈煜，郭亭等。rDNA介导的多拷贝整合表达载体的构建及其在酿酒酵母工业菌株中的应用。山东大学学报(理学版)，2005，40C3) :105-109)上构建而成。具体构建步骤如下(1)以载体pYES3/CT-vgb为模板扩增目的基因vgb ；(2)利用Bgl II分别酶切vgb片段和载体ρΥΜΙΚΡ，然后用T4DNA连接酶连接；(3)连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，筛选阳性克隆并通过PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pYM-vgb，最终获得重组表达质粒pYM-vgb ；(4)将测序正确的重组质粒pYM-vgb用限制性内切酶Kpn I酶切线性化，利用电击转化法将线本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王凤山，董坤，陈晓燕，朱希强，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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