一种消化酶组合物及其制剂、应用制造技术

本发明专利技术涉及干细胞分离技术领域，特别涉及一种消化酶组合物及其制剂、应用。该消化酶组合物包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。本发明专利技术提供的消化酶组合物能够高效地从胎盘组织块中分离MSC，提高了胎盘MSC的分离效率；本发明专利技术提供的消化酶组合物能够减少对细胞的损伤，从而使细胞活率高，同时具有较强的增殖能力，提高细胞收获量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞分离
，特别涉及。
技术介绍
间充质干细胞（MesenchymalStemCells，MSCs)是一群非造血功能的，主要存在 与结缔组织和器官间质中的一类同种多能干细胞。体外培养的实验研宄发现，在不同的诱 导条件下，胎盘MSC可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经元，并表达特异性标志， 如osteopontin、PPAR-y2、collagenII、NSE等，诱导体系与骨髓MSC没有太大的差别，表 明胎盘MSC同样具有广泛的分化潜能。近年来，已有具有干/祖细胞特征的间充质细胞自骨 髓、外周血、密质骨、软骨、肌肉等组织中分离出来，这些组织的一个共同特征就是来源于胚 胎发育期的中胚层，胎盘由滋养细胞及大量起源于胚外中胚层的间充质和血管共同组成， 提示胎盘中存在间充质干细胞（MSC)成分。科学家们经过证实确定胎盘中含有大量丰富的 MSCs。而且，胎盘MSC与骨髓MSC在细胞形态，细胞表面标志表达和基因表达模式上非常相 似。由于胎盘MSCs的数量很大，在今后的试验和临床应用上，胎盘已经成为一种无伦理学 争议和简便获得的MSCs的新来源。MSCs的分离一般采用胰蛋白酶消化，具体方法为：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干 净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1mm3大小，加 入a-MEM培养液置于37°C，5%的C02培养箱培养，培养液中含10%FBS，100U/mL青霉素， 100U/mL链霉素。脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小 的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用〇. 25%胰 蛋白酶消化传代。 从胎盘组织中分离MSC还有采取胶原酶消化组织块的办法。李铎于2011年报道 了应用胶原酶消化法对人脐带间充质干细胞进行分离培养。CN104284976A中采用胰蛋白酶和DNaseI对胎盘干细胞进行了分离培养，具体 为：在含有25mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES)的平衡盐溶液（HBSS)中，将35至40g胎盘 绒毛组织用0. 15%胰蛋白酶和0. 02%DNaseI在37°C下水浴消化30min，重复3次。在最 后两次消化中，静置组织碎片，用200uM孔径尼龙筛网过滤上清液，至多45mL细胞悬液分层 在5mLFCS血清上，室温1000Xg离心10min。 又如文献（姚旺祥等.兔胎盘源性间充质干祖细胞的分离方法比较.生物医学工 程与临床.2007年02期）采用II型胶原酶+DNaseI对胎盘组织进行消化。 但上述方法存在细胞收获率低或者细胞活力低的问题。因此，提供一种细胞收获 率高、细胞活力高的胎盘间充质干细胞的分离培养方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了。本专利技术提供的消化酶 组合物能够高效地从胎盘组织块中分离MSC，提高了胎盘MSC的分离效率；本专利技术提供的消 化酶组合物能够减少对细胞的损伤，从而使细胞活率高，同时具有较强的增殖能力，提高细 胞收获量。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案： 本专利技术提供了一种消化酶组合物，包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。 本专利技术使用胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶联合消化胎盘组织，使得消化 酶组合物产生了协同增效作用，提高了细胞的收获量及活率，减少了对细胞的损伤，提高了 增殖速率。 作为优选，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶体积比为（0. 1~10) : (0. 1~ 10):(0? 1 ~10)〇 优选地，胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶体积比为1 :〇. 5 :2。 本专利技术还提供了一种消化酶混合液，包括本专利技术提供的消化酶组合物和PBS ;该 消化酶组合物包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶；作为优选，胶原酶I、中性蛋白 酶与脱氧核糖核酸酶的体积比为（〇? 1~10) : (〇? 1~10) : (〇? 1~10);优选地，胶原酶I、 中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶体积比为1 :〇. 5 :2。 作为优选，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为0. 1~10yg/mL，中性蛋白酶的 浓度为〇. 1~10yg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为0. 1~10yg/mL。 在本专利技术提供的一些实施例中，胶原酶I的规格为125⑶U/mg。 在本专利技术提供的一些实施例中，中性蛋白酶的规格为50000U/g。 在本专利技术提供的一些实施例中，脱氧核糖核酸酶的规格2000Kunitzunits/mg。 在本专利技术提供的一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为1yg/mL， 中性蛋白酶的浓度为〇. 5yg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为2yg/mL。 在本专利技术提供的另一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为0. 1yg/ mL，中性蛋白酶的浓度为1yg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为10yg/mL。在本专利技术提供的另一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为5yg/mL，中性蛋白酶的浓度为10yg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为0. 1yg/mL。 在本专利技术提供的另一些实施例中，在消化酶混合液中，胶原酶I的浓度为10yg/ mL，中性蛋白酶的浓度为0. 1yg/mL，脱氧核糖核酸酶的浓度为1yg/mL。 本专利技术还提供了本专利技术消化酶组合物或消化酶混合液在分离间充质干细胞中的 应用；该消化酶组合物包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶；作为优选，胶原酶I、 中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的体积比为（〇. 1~10) :(〇. 1~10) :(〇. 1~10);优选地， 胶原酶I、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的体积比为1 :〇. 5 :2; 本专利技术消化酶混合液包括本专利技术消化酶组合物和PBS;作为优选，在消化酶混合 液中，胶原酶I的浓度为0. 1~10yg/mL，中性蛋白酶的浓度为0. 1~10yg/mL，脱氧核糖 核酸酶的浓度为〇. 1~10ug/mL。 在本专利技术提供的一些实施例中，间充质干细胞为胎盘间充质干细胞。 本专利技术还提供了一种分离胎盘间充质干细胞的方法，采用本专利技术消化酶组合物， 或者采用本专利技术消化酶混合液消化胎盘组织。 作为优选，消化的温度为36~38°C。 优选地，消化的温度为37°C。 作为优选，消化的时间为10~60min。 优选地，消化的时间为30min。 本专利技术提供了。该消化酶组合物包括胶原酶I、 中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。本专利技术至少具有如下优势之一： 本专利技术提供的消化酶组合物能够高效地从胎盘组织块中分离MSC，提高了胎盘 MSC的分离效率； 本专利技术提供的消化酶组合物能够减少对细胞的损伤，从而使细胞活率高，同时具 有较强的增殖能力，提高细胞收获量。【附图说明】 图1示分离获得的MSCs的形态（P1代）；A(40倍）和B(100倍）示用消化酶混合 液1获得的人MSCs，并用Gimsa染色观察其细胞形态；C(40倍）和D(100倍）用消化酶混 合液2获得的人MSCs并用Gimsa染色观察其细胞形态； 图2示流式细胞术检测胎盘贴壁细胞表型，表面抗原包括⑶14、⑶29、⑶34、⑶44、 ⑶45、⑶73、⑶90、⑶105 ;其中2-1示消化酶混合液1消化获得细胞表型；2-2示消化酶混 合液2消化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种消化酶组合物，其特征在于，包括胶原酶I、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，卢瑞珊，王小燕，李平，马岩岩，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44