源于红树林沉积物的可降解孔雀石绿的过氧化物酶及制备，涉及一种过氧化物酶，过氧化物酶基因来自红树林沉积物微生物宏基因组序列。克隆过氧化物酶基因，再插入表达载体，构建携带过氧化物酶的重组表达载体；将重组表达载体转化到E.coli BL21(DE3)中；选取转化后E.coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中发酵培养；离心收集发酵后的E.coli BL21(DE3)细胞，重悬E.coli BL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中裂解，离心，收集上清液，再与预先结合NiSO4的R10-Flammable混匀，咪唑洗脱，得过氧化物Mgv-rPOD。所得过氧化物酶对孔雀石绿具有显著降解活性。
【技术实现步骤摘要】
源于红树林沉积物的可降解孔雀石绿的过氧化物酶及制备
本专利技术涉及一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶，尤其是涉及一种源于红树林沉积物的可降解孔雀石绿的过氧化物酶及制备。
技术介绍
孔雀石绿(MalachiteGreen,MG)是一种三苯基甲烷类染料，应用于造纸业、纺织业和皮革业。而其因具有高效的抗菌作用也被广泛应用于养殖业。但近年来的研究表明孔雀石绿对哺乳动物细胞有极强的致癌性和致畸变性(Fessardetal.1999；Srivastavaetal.2004)，因此已被许多国家禁止使用。然而由于孔雀石绿在拮抗水产病原菌方面的有效性且缺乏合适的替代物，导致其仍被大量使用，由此对近海生态环境和人类健康造成了很大程度的威胁。过氧化物酶(Peroxidase,EC1.11.1)是一类以有机物为底物的氧化酶类，通过夺取其电子并传递给活性氧基团以达到清除自由基、保护细胞的作用(Thomasetal.1980)，同时过氧化物酶也与工业染料等大分子物质降解相关。Anirban等发现辣根过氧化物酶可以降解多种工业染料(Anirbanetal.2001)，同时Ramesh等和Liaquat等均发现一些微生物和动物来源的过氧化物酶对大分子物质有着降解的作用(Anirbanetal.2001；Rameshetal.2013；Liaquatetal.2013)。专利方面，多种来源的过氧化物酶被应用于定量、显色和化学修饰等领域，但通过红树林沉积物宏基因组测序得到的过氧化物酶应用于孔雀石绿降解及环境修复上并不多见。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种源于红树林沉积物的过氧化酶基因mgv-peroxidase。本专利技术的第二目的是提供一种由所述过氧化酶基因mgv-peroxidase编码的过氧化物酶Mgv-rPOD。本专利技术的第三目的是提供所述过氧化物酶Mgv-rPOD的制备方法。本专利技术的第四目的是提供所述过氧化物酶Mgv-rPOD在对孔雀石绿降解中的应用。本专利技术技术方案如下：源于红树林沉积物的过氧化酶基因mgv-peroxidase，所述过氧化物酶基因来源于红树林沉积物宏基因组序列；所述过氧化物酶基因mgv-peroxidase的序列(SEQIDNo.1)如下：SEQIDNo.1的信息：1)名称：过氧化物酶基因mgv-peroxidase；2)分子类型：DNA；3)序列特征：A)长度：561bp；B)类型：核酸；C)链性：双链；D)拓扑结构：线性。所述过氧化酶基因mgv-peroxidase编码的过氧化物酶Mgv-rPOD，其氨基酸序列(SEQIDNo.2)如下：SEQIDNo.2的信息：1)名称：过氧化物酶Mgv-rPOD；2)分子类型：蛋白质；3)序列特征：A)长度：186aa；B)类型：氨基酸。所述过氧化物酶Mgv-rPOD的制备方法，包括以下步骤：1)克隆所述过氧化物酶基因mgv-peroxidase；2)将所述mgv-peroxidase插入表达载体，构建携带所述过mgv-peroxidase的重组表达载体；3)将所述重组表达载体转化到E.coliBL21(DE3)中；4)选取转化后E.coliBL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；5)离心收集发酵后的E.coliBL21(DE3)细胞，重悬所述E.coliBL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中进行裂解；6)将步骤5)中裂解后的悬液进行离心，收集上清液；7)将上清液与将上清液与预先结合NiSO4的R10-Flammable混匀，4℃结合45分钟，用浓度为200mM的咪唑洗脱即得所述过氧化物酶Mgv-rPOD。在步骤2)中，所述表达载体可为pET-32a载体。在步骤4)中，所述培养基可为含有100μg/mL氨苄青霉素和0.7％葡萄糖的2×YT培养基。在步骤4)中，所述发酵条件可为：37℃下振荡培养至A600＝0.5，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1mM，而后于25℃诱导10小时。在步骤5)中，所述裂解缓冲液配方可为：0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0。在步骤6)中，所述离心的条件可为4000rpm，离心20min。所述过氧化物酶在降解孔雀石绿中的应用。本专利技术所述过氧化物酶Mgv-rPOD的突出特点表现为：1、新型的基因序列，在NCBI数据库中没有相似的完整ORF基因序列。2、纯化后的过氧化物酶具有高效降解孔雀石绿的功能。3、过氧化物酶能够在大肠杆菌中稳定表达，制备方法的步骤4)中加入葡萄糖可大幅降低本底表达并能够维持质粒在大肠杆菌中的稳定性。4.纯化后的过氧化物酶Mgv-rPOD在低温条件下(20℃)仍具有极强的孔雀石绿降解活性，可以适应实际低温条件下对孔雀石绿污染的修复。5.过氧化物酶Mgv-rPOD对盐度、金属螯合剂及除Cu2+外的金属离子都有很强的抗性和适应性，可以适应在成分复杂的环境中降解孔雀石绿。本专利技术从红树林沉积物环境宏基因组中克隆得到过氧化物酶基因mgv-peroxidase，转化到大肠杆菌中进行稳定大量的外源表达，得到一种过氧化物酶Mgv-rPOD。该酶能高效降解孔雀石绿，对由孔雀石绿引起的环境污染的修复有着重要的意义。本专利技术提供了一种过氧化物酶基因的克隆表达、蛋白快速纯化的方法。附图说明图1为过氧化物酶重组表达纯化的SDS-PAGE图谱。在图1中，M为蛋白marker，1为未诱导细菌破碎液，2为IPTG诱导后细菌破碎液，3为纯化后的Mgv-rPOD。图2为Mgv-rPOD最适pH。在图2中，横坐标为pH值，纵坐标为孔雀石绿脱色率(％)。图3为Mgv-rPOD最适反应温度。在图3中，横坐标为温度(℃)，纵坐标为孔雀石绿脱色率(％)。图4为孔雀石绿浓度对Mgv-rPOD降解孔雀石绿的影响。在图4中，横坐标为反应时间(h)，纵坐标为孔雀石绿脱色率(％)。图5为金属离子对Mgv-rPOD降解孔雀石绿的影响。在图5中，横坐标为孔雀石绿脱色率(％)，纵坐标为使用的金属离子。图6为潜在的抑制剂对Mgv-rPOD降解孔雀石绿的影响。在图6中，横坐标为孔雀石绿脱色率(％)，纵坐标为可能的降解抑制剂。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，2002)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的条件。1.红树林沉积物环境微生物总DNA(eDNA)的提取取出保存在-80℃冰箱中的红树林沉积物并置于4℃下融化，采用MoBio土壤微生物提取试剂盒(SoilDNAIsolationKit，购自MoBio公司)提取环境总DNA(eDNA)，操作过程按试剂盒说明书进行。2.过氧化物酶基因mgv-peroxidase的PCR扩增和序列分析根据红树林沉积物环境微生物宏基因组测序后的基因注释结果，设计mgv-peroxidase的引物F：5’-ACGGCGAATTCTCCTGGATTGACGAGATTGAAATCGACGAA-3’(划线为EcoRI酶切位点)(SEQIDNo.3)，R：5’-ATTCTGGTCG本文档来自技高网...
【技术保护点】
源于红树林沉积物的过氧化酶基因mgv‑peroxidase，其特征在于，所述过氧化物酶基因来源于红树林沉积物宏基因组序列；所述过氧化物酶基因mgv‑peroxidase的序列(SEQ ID No.1)如下：SEQ ID No.1的信息：1)名称：过氧化物酶基因mgv‑peroxidase；2)分子类型：DNA；3)序列特征：A)长度：561bp；B)类型：核酸；C)链性：双链；D)拓扑结构：线性。
【技术特征摘要】
1.源于红树林沉积物的过氧化酶基因mgv-peroxidase，其特征在于，所述过氧化物酶基因来源于红树林沉积物宏基因组序列；所述过氧化物酶基因mgv-peroxidase的序列(SEQIDNo.1)如下：SEQIDNo.1的信息：1)名称：过氧化物酶基因mgv-peroxidase；2)分子类型：DNA；3)序列特征：A)长度：561bp；B)类型：核酸；C)链性：双链；D)拓扑结构：线性。2.如权利要求1所述过氧化酶基因mgv-peroxidase编码的过氧化物酶Mgv-rPOD，其特征在于，其氨基酸序列(SEQIDNo.2)如下：SEQIDNo.2的信息：1)名称：过氧化物酶Mgv-rPOD；2)分子类型：蛋白质；3)序列特征：A)长度：186aa；B)类型：氨基酸。3.如权利要求2所述过氧化物酶Mgv-rPOD的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)克隆所述过氧化物酶基因mgv-peroxidase；2)将所述mgv-peroxidase插入表达载体，构建携带所述mgv-peroxidase的重组表达载体；3)将所述重组表达载体转化到E.coliBL21(DE3)中；4)选取转化后E.coliBL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晶，曲武，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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