本发明专利技术公开了一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体和一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫检测方法与试剂盒。本发明专利技术的单克隆抗体是由杂交瘤细胞4B10所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC?NO：C201143。本发明专利技术的酶联免疫检测方法包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤。与现有技术相比，本发明专利技术制备的单克隆抗体可以同时识别无色结晶紫、孔雀石绿、无色孔雀石绿，本发明专利技术的检测方法和试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的单克隆抗体及一种用于检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫方法与试剂盒。
技术介绍
孔雀石绿、结晶紫属于三苯甲烷类染料，可用作杀菌、驱虫剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类。由于孔雀石绿和结晶紫具有潜在的致癌性，已被许多国家禁用，但是目前还存在非法使用的现象，因此很有必要加强对于该药的检验监测。孔雀石绿和结晶紫可分别代谢为无色孔雀石绿及无色结晶紫，目前，对于孔雀绿、 结晶紫及其代谢物残留检测的方法主要是高效液相色谱法，该方法虽然灵敏、准确，但样品前处理繁琐、检测时间长、耗资大、技术性要求高，且要有昂贵的仪器，不适合大量样品的高通量检测。酶联免疫检测方法(ELISA)是利用免疫反应(即抗原-抗体结合反应)的高度特异性和酶促反应的高度敏感性对药物进行定性和定量分析的一种综合性检测技术，它具有操作简便、高通量、高灵敏度、低费用等优点，能克服仪器检测方法的不足之处。申请号为200810202733. 8的中国专利公开了一种检测孔雀石绿的酶联免疫试剂及方法，该专利技术采用活泼酯法将孔雀石绿半抗原分别与钥孔槭血蓝蛋白和牛丙种球蛋白偶联得到免疫原和包被原，所得到的酶联免疫试剂及方法仅能检测孔雀石绿，无法检测其代谢产物及结晶紫的代谢产物。申请号为200910058317. X的另一篇中国专利公开了测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是合成氨基无色孔雀石绿作为半抗原，分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白偶联得到免疫原和包被原，通过免疫动物获得多克隆抗体，该专利技术所采用的半抗原合成方法复杂，涉及到加氢等比较危险的反应体系。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是对孔雀石绿半抗原进行结构改造，合成对_无色孔雀石绿作为半抗原，进而提供出一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的单克隆抗体。本专利技术的第二个目的是利用所述该单克隆抗体，建立一种能用于孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫检测的酶联免疫方法。本专利技术的第三个目的是提供一种检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫试剂盒。本专利技术的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫的酶联免疫试剂盒中的应用。本专利技术的第五个目的是提供包含所述单克隆抗体的试剂盒在动物源性食品中孔雀石绿、无色孔雀石绿、无色结晶紫检测中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现一种能识别孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO C201143的杂交瘤细胞4B10所分泌的。上述杂交瘤细胞4B10，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO C201143o所用的免疫原是由半抗原对-无色孔雀石绿与人血清白蛋白偶联制备的。进一步，本专利技术提供了一种用于孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫检测的酶联免疫方法，包括以下步骤(I)将半抗原对_无色孔雀石绿(LMG-HEO)与人血清白蛋白 (HSA)偶联得到免疫原(LMG-HE0-HSA)；(2)将半抗原对-无色孔雀石绿(LMG-HEO)与卵清蛋白(OVA) 偶联得到包被原(LMG-HE0-0VA)；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO C201143的杂交瘤细胞4B10 ；(4)用保藏号为CCTCC NO C201143的杂交瘤细胞4B10制备单克隆抗体；(5)用步骤⑵的包被原包被固相载体(如酶标板)；(6)取均质好的组织样品，用乙腈超声提取、离心，取乙腈层用氮气吹干，残渣用含 O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待测物； (7)取待测物进行ELISA检测。步骤(6)含O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法为准确称取三羟甲基胺基甲烷(Tris)1.211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调pH值至7. 4，再加O. 5mL吐温20溶解， 定容至1000mL。本专利技术以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法， 实现了对动物可食性组织中孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫的酶联免疫检测。本专利技术的主要优点是I.本专利技术制备的单克隆抗体能同时检测孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫， 识别范围广，灵敏度高。2.本专利技术设计的半抗原合成工艺简便、效率高，所用的主要有机试剂避免了高毒性，对操作者身体健康危害小。3.本专利技术所使用的人工抗原载体为人血清白蛋白，在现有专利和文献中未见报道和使用，免疫效果优于牛血清白蛋白做载体的免疫原。4.本专利技术涉及的ELISA检测方法以含O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的 Tris-HCl溶液为标准品稀释液和样品稀释液，对待测物的溶解性好，所得标准曲线线性好， 检测结果的准确度和精密度好。附图说明图I为本专利技术免疫原LMG-HE0-HSA的MALDI-T0F/T0F图谱。图2为本专利技术载体蛋白HSA的MALDI-T0F/T0F图谱。图3为本专利技术的单克隆抗体与无色结晶紫标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫三种标准溶液浓度对数值，Y轴为孔雀石绿、无色孔雀石绿和无色结晶紫三种标准品溶液的光密度值除以“O”孔光密度值(B/Bd。具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。实施例I半抗原的制备I. I合成对-苯甲醛干燥处理取一瓶N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) 500ml加无水硫酸钠60g，震荡，静置过夜，减压过滤，收集干燥后的DMF于一干燥的IOOOml单口瓶,密封,置干燥阴凉处备用。药品称量准确称取4-羟基-苯甲醛34g，碳酸钾28g，4_溴丁酸乙酯68g。羟基烷基化反应将以上称取的三种药品一起加入到200ml干燥DMF中，110°C回流反应过夜。静置至室温，过滤，滤液用乙酸乙酯提取，抽真空干燥。获得具有水果清香味的无色油状液体，即为对-苯甲醛。I. 2合成对-无色孔雀石绿称量准确称(量)取步骤I所获的对_苯甲醛Sg，N， N 二甲苯胺30ml，对甲苯磺酸15g。傅克反应将以上称量的三种物质混合，120°C搅拌反应过夜。静置至室温，加 13g固体碳酸钾中和反应体系。乙酸乙酯提取后，抽真空干燥。得到橙色油状物，即为对-无色孔雀石绿。柱色谱纯化采用湿法填柱进样，以乙酸乙酯正己烷=I 6为流动相纯化上述得到的对-无色孔雀石绿。I. 3合成对-无色孔雀石绿称量准确称(量)取步骤2所获的对-无色孔雀石绿 6g，甲醇四氢呋喃=3 2混合溶液300ml，4N NaOH溶液50ml。皂化反应将以上称量的物质混合，室温搅拌反应过夜(16小时)。真空除掉有机溶剂部分，吸出水层底部的少量油滴，用乙酸乙酯正己烷=I 4萃洗，弃正己烷层，静置于4°C，待溶液中出现大量亮色薄片状物质时，过滤，得到肉黄色粘土状粗品。将其均匀铺开，静置干燥。用研钵磨细，得到蓝绿色固体，即为对-无色孔雀石绿 (LMG本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，翟长友，彭大鹏，王玉莲，潘源虎，黄玲利，陈冬梅，陶燕飞，戴梦红，刘振利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。