本发明专利技术公开了一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，它包括磁性分子印迹聚合物的制备和直接竞争ELISA方法的建立等实验步骤，本发明专利技术首先用乳液聚合法制备了粒径均匀的孔雀石绿磁性分子印迹聚合物（MG-MMIPs），并考察其吸附性能，将此MG-MMIPs作为仿生抗体，利用它对MG抗原和酶标记MG抗原的竞争性吸附，建立直接竞争的ELISA检测方法。该方法在最适反应条件下建立的标准曲线灵敏度为20.14μgL-1，最低检出限为0.12μgL-1，低于孔雀石绿快速检测卡的检出限2ppb(ng/g)；同时，该方法对MG具有很高的选择性，对MG的两种结构类似物（甲基紫和亮绿）的交叉反应率分别为7.4%和3.9%。
【技术实现步骤摘要】
一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法
本专利技术涉及一种较大范围，具体是一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法。
技术介绍
孔雀石绿(MalachiteGreen，MG)是一种三苯甲烷类物质，又称为盐基块绿、碱性孔雀绿、孔雀绿、碱性绿、中国绿或苯胺绿，为具有金属光泽的深绿色结晶状固体。孔雀石绿曾经在许多行业均有应用，如皮革业、食品染色业、制陶业、印染业等。由于MG对于水生动物疾病的防疫和治疗可以起到很好的疗效，从1936年开始便广泛应用于水产养殖中。孔雀石绿也可用作杀菌剂，对于防止霉菌在鱼卵中生长以及真菌的二次污染有较好的效果。但是，孔雀石绿存在高毒、高残留和高致癌、诱变的缺点。我国在2002年5月已将其定为水产生物违禁用药，但由于其价格低廉，而且杀菌效果显著，目前仍有不法商户还在使用。由于其添加量很少就可以达到很好的杀菌效果，给检测水产品中的MG带来一定的难度。因此，建立MG残留的检测方法十分迫切并且具有重要的现实意义。目前MG的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、以及气相色谱-质谱联用法。这些方法在测定和分析水产品中孔雀石绿的残留都具有结果可靠、灵敏度高、选择性高、重复性好的优点。但是这些方法在样品前处理过程都存在繁琐复杂、耗时等不足，而且设备昂贵，检测成本高；不仅需要消耗大量的溶剂和大量的时间，还容易造成二次污染，影响检测结果的准确性。因此，发展一种快速高效的MG的检测方法对控制水产品质量安全具有重要意义。分子印迹聚合物具有构效预定性、特异识别性和广泛适用性的显著特点，而酶联免疫法检测快速、灵敏。将二者结合起来，以合成的分子印迹聚合物作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且可以重复利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，具体步骤如下：(1)Fe3O4的合成：称取0.30～0.36g聚乙二醇，加入7～9mL超纯水，超声直至聚乙二醇完全溶解，称取2.00～2.06gFeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取1.4～1.6gFeCl2加入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0.4～0.6mL0.1molL-1稀盐酸，通氮除氧12～18min，60℃水浴下边搅拌边迅速加入55～65mL氨水，调转速至1500rmin-1，反应1h，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱4～6次，真空冷冻干燥后保存备用；(2)预聚合溶液的配制：将0.08～0.12gFe3O4加入0.8～1.2mL油酸中并用玻璃棒搅拌均匀，加入8～12mL0.05molL-1MG氯仿溶液和43～170μL功能单体，在400rmin-1的转速下搅拌25～35min，4℃下静置1.5～2.5h形成A液；(3)预乳化溶液的配制：将Span-80和tween-80各0.4～0.6mL加入22～28mL超纯水中，再加入475～950μL交联剂，在400rmin-1下搅拌25～35min形成B液；(4)MG磁性分子印迹聚合物的制备：在400rmin-1转速搅拌下，将A液缓慢加入到B液中，氮气除氧18～22min，将温度升到60℃，加入0.08～1.2g偶氮二异丁腈引发聚合16～20h，反应结束后用22～28mL甲醇破乳，抽滤后得到粗孔雀石绿磁性分子印迹聚合物，产物用体积比为8～10:1的甲醇-乙酸混合液索氏提取至无孔雀石绿模板洗出，再用甲醇洗至中性，最后用超纯水洗去甲醇，真空冷冻干燥后备用；(5)半抗原的合成：将850～950mg4-甲酰基苯甲酸、2.2～2.6mLN,N-二甲基苯胺和2.2～2.6g无水ZnCl2溶解在60mL无水乙醇中，氮气保护下加热回流22～26h，室温冷却后，加入28～32mL甲醇，滴加氨水至沉淀产生，过滤后用水冲洗，真空中用KOH进行干燥得到羧基化的隐性孔雀石绿；三氯甲烷溶解羧基化的隐性孔雀石绿，加入四氯对苯醌、冰醋酸25℃下搅拌反应1～2h，反应产物经等体积的三氯甲烷-四氯甲烷洗涤2～3次，真空干燥可获得半抗原羧基化孔雀石绿粉末；(6)酶标抗原的合成：将1.8～2.2mg半抗原羧基化孔雀石绿CMG粉末溶于0.8～1.2mL20％N,N-二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入1.8～2.2mgmL-1EDC32～24μL，调pH4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入7.0～8.0mg辣根过氧化物酶HRP，调pH至7.8～7.2，室温反应2.5～3.5h得到CMG-HRP偶联物，20℃冷冻保存；(7)检测：取18～22mg磁性分子印迹聚合物置于10mL离心管中，加入浓度为0.1～10000μgL-1的MG-PBS缓冲溶液2.8～3.2mL，然后立即加入稀释度为1：1400～1600的酶标抗原溶液2.8～3.2mL，不加MG溶液的离心管为对照组，冰浴振荡吸附1.5～2.5h；弃上层溶液，每管加入140～160μL底物显色液，显色25～35min后每管加入45～55μL终止液，立即在酶标仪上读数，计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(2)中的功能单体为α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(3)中的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯苯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(7)中的底物显色液为邻苯二胺。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤(7)中的终止液为2molL-1的硫酸。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术磁性分子印迹聚合物具有特异识别性和使固液快速分离的显著特点，而酶联免疫法检测具有快速和灵敏的特点，将二者结合起来，以合成的分子印迹聚合物作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且可以重复利用。附图说明图1为本专利技术中磁性分子印迹聚合物电镜扫描图；图2为本专利技术中磁性分子印迹聚合物傅里叶红外光谱图；图3本专利技术中为磁性分子印迹聚合物磁滞回线；图4和图5为本专利技术中磁性分子印迹聚合物热重图；图6为本专利技术中酶标抗原紫外光谱图；图7为本专利技术中半抗原CMG红外光谱图；图8为本专利技术中MG直接竞争ELISA标准曲线；图9为ELISA和HPLC法对样品中MG测定结果的一致性。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，具体步骤如下：(1)Fe3O4的合成：称取0.33g聚乙二醇，加入8mL超纯水，超声直至聚乙二醇完全溶解，称取2.03gFeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取1.5gFeCl2加入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0.5mL0.1molL-1稀盐酸，通氮除氧15min，60℃水浴下边搅拌边迅速加入60mL氨水，调转速至1500rmin-1，反应1h，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱5次，真空冷冻干燥后保存备用；(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)Fe3O4的合成：称取0.30～0.36g聚乙二醇，加入7～9mL超纯水，超声直至聚乙二醇完全溶解，称取2.00～2.06g FeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取1.4～1.6g FeCl2加入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0.4～0.6mL 0.1mol L‑1稀盐酸，通氮除氧12～18min，60℃水浴下边搅拌边迅速加入55～65mL氨水，调转速至1500r min‑1，反应1h，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱4～6次，真空冷冻干燥后保存备用；(2)预聚合溶液的配制：将0.08～0.12g Fe3O4加入0.8～1.2mL油酸中并用玻璃棒搅拌均匀，加入8～12mL 0.05mol L‑1MG氯仿溶液和43～170μL功能单体，在400r min‑1的转速下搅拌25～35min，4℃下静置1.5～2.5h形成A液；(3)预乳化溶液的配制：将Span‑80和tween‑80各0.4～0.6mL加入22～28mL超纯水中，再加入475～950μL交联剂，在400r min‑1下搅拌25～35min形成B液；(4)MG磁性分子印迹聚合物的制备：在400r min‑1转速搅拌下，将A液缓慢加入到B液中，氮气除氧18～22min，将温度升到60℃，加入0.08～1.2g偶氮二异丁腈引发聚合16～20h，反应结束后用22～28mL甲醇破乳，抽滤后得到粗孔雀石绿磁性分子印迹聚合物，产物用体积比为8～10:1的甲醇‑乙酸混合液索氏提取至无孔雀石绿模板洗出，再用甲醇洗至中性，最后用超纯水洗去甲醇，真空冷冻干燥后备用；(5)半抗原的合成：将850～950mg 4‑甲酰基苯甲酸、2.2～2.6mL N,N‑二甲基苯胺和2.2～2.6g无水ZnCl2溶解在60mL无水乙醇中，氮气保护下加热回流22～26h，室温冷却后，加入28～32mL甲醇，滴加氨水至沉淀产生，过滤后用水冲洗，真空中用KOH进行干燥得到羧基化的隐性孔雀石绿；三氯甲烷溶解羧基化的隐性孔雀石绿，加入四氯对苯醌、冰醋酸25℃下搅拌反应1～2h，反应产物经等体积的三氯甲烷‑四氯甲烷洗涤2～3次，真空干燥可获得半抗原羧基化孔雀石绿粉末；(6)酶标抗原的合成：将1.8～2.2mg半抗原羧基化孔雀石绿CMG粉末溶于0.8～1.2mL 20％N,N‑二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入1.8～2.2mg mL‑1EDC 32～24μL，调pH 4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入7.0～8.0mg辣根过氧化物酶HRP，调pH至7.8～7.2，室温反应2.5～3.5h得到CMG‑HRP偶联物，20℃冷冻保存；(7)检测：取18～22mg磁性分子印迹聚合物置于10mL离心管中，加入浓度为0.1～10000μgL‑1的MG‑PBS缓冲溶液2.8～3.2mL，然后立即加入稀释度为1：1400～1600的酶标抗原溶液2.8～3.2mL，不加MG溶液的离心管为对照组，冰浴振荡吸附1.5～2.5h；弃上层溶液，每管加入140～160μL底物显色液，显色25～35min后每管加入45～55μL终止液，立即在酶标仪上读数，计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率。...
【技术特征摘要】
1.一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)Fe3O4的合成：称取0.30～0.36g聚乙二醇，加入7～9mL超纯水，超声直至聚乙二醇完全溶解，称取2.00～2.06gFeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取1.4～1.6gFeCl2加入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0.4～0.6mL0.1molL-1稀盐酸，通氮除氧12～18min，60℃水浴下边搅拌边迅速加入55～65mL氨水，调转速至1500rmin-1，反应1h，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱4～6次，真空冷冻干燥后保存备用；(2)预聚合溶液的配制：将0.08～0.12gFe3O4加入0.8～1.2mL油酸中并用玻璃棒搅拌均匀，加入8～12mL0.05molL-1MG氯仿溶液和43～170μL功能单体，在400rmin-1的转速下搅拌25～35min，4℃下静置1.5～2.5h形成A液；(3)预乳化溶液的配制：将Span-80和tween-80各0.4～0.6mL加入22～28mL超纯水中，再加入475～950μL交联剂，在400rmin-1下搅拌25～35min形成B液；(4)MG磁性分子印迹聚合物的制备：在400rmin-1转速搅拌下，将A液缓慢加入到B液中，氮气除氧18～22min，将温度升到60℃，加入0.08～1.2g偶氮二异丁腈引发聚合16～20h，反应结束后用22～28mL甲醇破乳，抽滤后得到粗孔雀石绿磁性分子印迹聚合物，产物用体积比为8～10:1的甲醇-乙酸混合液索氏提取至无孔雀石绿模板洗出，再用甲醇洗至中性，最后用超纯水洗去甲醇，真空冷冻干燥后备用；(5)半抗原的合成：将850～950mg4-甲酰基苯甲酸、2.2～2.6mLN,N-二甲基苯胺和2.2～2.6g无水ZnCl2溶解在60mL无水乙醇中，氮气保护下加热回流22～26h，室温冷却后，加入28～32mL甲醇，滴加氨水至沉淀产生，过...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄志勇，李璐，林郑忠，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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