一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，采用酸法与酶法相结合的工艺，保持恒低温无菌的环境，利用同样浓度的盐溶液进行两次盐析与离心，简化了提纯步骤。所用酸为低浓度酸溶液，并采用柠檬酸替代醋酸进行提纯。从提取原料到样品生成过程中，进行多次真空冷冻干燥，并经进一步处理获得含水率在3％以下的胶原蛋白微粉；最后由灭菌、无菌包装，成品胶原蛋白粉末的纯度在98％以上。本发明专利技术获得的胶原蛋白降低了蛋白的免疫原性，提高了产率和生物相容性，降低了成本，适用于生物医用材料，所得到的胶原蛋白能完整地保留其特有的三股螺旋结构。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
胶原蛋白是细胞外基质的主要组成成分，是动物体内含量最多，分布最广的蛋白质。胶原蛋白有着独特的三股螺旋结构，并含有独特的羟脯氨酸，具有良好的生物相容性和可生物降解性。与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递以及关节润滑、伤口愈合、钙化作用、血液凝固和衰老等有着密切的关系。鼠尾胶原蛋白是I型胶原蛋白，I型胶原蛋白广泛存在于动物的肌腱、皮肤、骨等组织中。I型胶原蛋白具有自组装成纤维特性，可用于细胞培养及制作组织工程中的三维支架材料，使细胞在接近真实环境中生长。目前对于胶原的提取方法依然停留在传统阶段，如酸溶法、碱溶法、酶法、超声法等，各有优缺点。传统方法不但提取率低，还容易破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，降低其生物功能性。提取的胶原蛋白要用于生物医药方面，必须考虑到无菌性、生物相容性、免疫原性等问题。针对这些问题，至今未有生物医用鼠尾胶原提取纯化工艺的报道。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的为提供。本专利技术的目的通过如下技术实现:，包括以下步骤:(I)将无组织纤维、脂肪和多糖残留的鼠尾腱，真空冷冻干燥备用；(2)冻干鼠尾腱经低温冻干粉碎至200?400目；(3)在冰水浴中将粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶胀，鼠尾腱与醋酸的固液比为I克:10mL?I克:120mL，期间不断搅拌，防止冻结成块，得到胶原溶胀液；(4)称取胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，鼠尾腱与蛋白酶质量比为50: I?100: I，在4°C，48?74小时酶解，期间间歇性搅拌；(5)将黏稠的胶体溶液进行高速冷冻离心处理，收集上清液；在冰水浴中，用的3?6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4°C沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀；(6)用0.03?0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中，调节pH = 6.5，用的3?6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4°C沉淀10小时，去除上清液，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀； (7)用0.03?0.06mol/L的柠檬酸再次溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，调节PH = 6.5 ;溶液依次通过阳离子交换树脂、阴离子交换树脂进行脱盐处理；(8)将脱盐后的胶原蛋白溶液，-40至_20°C预冻2?4小时，然后真空冷冻干燥，冻干产品经进一步处理得到含水率在3%以下的胶原蛋白微粉，灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末。本专利技术还据有如下技术特征:1、如上所述步骤(3)中醋酸溶液浓度为0.04?0.lmol/L,溶胀I?2小时。2、如上所述步骤(4)中胃蛋白酶的酶活力1: 10000。3、如上所述步骤(4) (5)和(6)中高速冷冻离心处理，温度为4°C，转速为8000?15000r/min，离心时间为15?30分钟。4、如上所述步骤(7)中依次通过732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂。5、如上所述步骤(7)进行脱盐处理或用透析袋动态透析72小时，用硝酸银检测无沉淀析出，透析完成。本专利技术所提供的胶原蛋白提取方法与现有技术相比，具有以下优点:(I)、本专利技术从原料处理、提取过程、产品生成保证了试剂药品和操作环境无菌，从而确保了提取的生物医用胶原蛋白无菌无毒。(2)、本专利技术中采用控制原料预冻，真空冷冻干燥的方法可以保证原料的长期贮存，适于工业化生产。两次冷冻干燥可以降低生物医用材料的抗原性，大大提升应用安全性。(3)、本专利技术中所用的醋酸浓度低于传统提取浓度，保证了胶原蛋白在酸性环境中三股螺旋结构的稳定，从而保证胶原蛋白的生物功能性。(4)、本专利技术在提取后换用柠檬酸代替醋酸进行样品的纯化，比传统方法提取的胶原蛋白，提高了其生物相容性，更适用于生物医用材料。(5)、本专利技术简化了生产工艺，结合多种酸溶法、酶解法提升了成品的提取率。提取率达到75?80%，纯度达到98%以上，提取率有了显著的提高，可用于工业化生产。￠)、本专利技术提取的生物医用鼠尾胶原蛋白可制成注射胶原，可取代常规整容中的硅胶等填充物，对疤痕组织进行填充性修复。对现有血管支架材料进行胶原修饰，可确保移植血管完全无血液漏出血管壁，进一步促进细胞和其它结缔组织成分在移植血管表面生长增殖，充当移植修复的临时支架。胶原精制而成的人工角膜，为盲人提供了更大希望。胶原缝线吸收好，是手术中的新材料。【附图说明】图1为胶原蛋白的傅里叶红外光谱分析。图2为胶原蛋白的紫外光光谱分析。图3为胶原蛋白的圆二色谱分析。图4为胶原蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析；其中，a为本专利技术所获得的胶原蛋白，b为索莱宝蛋白marker。【具体实施方式】下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1生物医用鼠尾胶原蛋白的提取，步骤如下:(I)取新鲜鼠尾1kg，置于1: 1000新洁尔灭液内浸泡1min?15min，取出后用生理盐水反复冲洗5次以上；分离鼠尾腱，去除鼠尾腱残留的组织纤维等。NH4C1_生理盐水溶液浸泡24h，4°C保持低速搅拌24h，中间换两次液去除残留的脂肪和多糖。去离子水冲洗5次，-20°C预冻4h，真空冷冻干燥备用；所述鼠尾来自于成年海狸鼠、各品系大鼠鼠尾或各品系小鼠鼠尾。(2)冻干鼠尾腱经低温冻干粉碎至200?400目；(3)在冰水浴中将鼠尾腱在0.06mol/L的醋酸溶液中溶胀2小时，期间不断搅拌，防止冻结成块；(4)、取14克胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，酶活力1: 10000，在4°C，74h酶解，期间间歇性搅拌；(5)将黏稠的胶体溶液用高速冷冻离心机4°C、12000r/min、离心30分钟，收集上清液。在冰水浴中，用的4mol/L的NaCl溶液盐析，4°C沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4°C、12000r/min、离心30分钟，收集沉淀；(6)、用0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH = 6.5，用3mol/L的NaCl溶液盐析，4°C沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液用高速冷冻离心机4°C、12000r/min、离心30分钟，收集沉淀；(7)、用0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，用50g/L的Na2HPO4标定pH = 6.5 ;溶液依次通过732强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，D311大孔丙烯酸系弱碱阴离子交换树脂，进行脱盐处理。(8)、将脱盐后的胶原蛋白溶液，_40°C预冻2小时，进而在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冻干产品经进一步处理可得到胶原蛋白微粉(含水率在3%以下)，钴60辐照灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末，纯度达到98%以上。实施例2，步骤如下:(I)、取新鲜鼠尾lkg，置于1: 1000新洁尔灭液内浸泡1min?15min，取出后用生理盐水反复冲洗5次以上；分离鼠尾腱，去除鼠尾腱残留的组织纤维等。NH4C1_生理盐水溶液浸泡24h，4°C保持低速搅拌24h，中间换两次液去除残留的脂肪和多糖。去离子水冲洗5次，_40°C预冻2h，真空冷冻干燥备用；(2)、冻干鼠尾经低温冻干粉碎至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将无组织纤维、脂肪和多糖残留的鼠尾腱，真空冷冻干燥备用；(2)冻干鼠尾腱经低温冻干粉碎至200～400目；(3)在冰水浴中将粉碎的鼠尾腱在醋酸溶液中溶胀，鼠尾腱与醋酸的固液比为1克∶100mL～1克∶120mL，期间不断搅拌，防止冻结成块，得到胶原溶胀液；(4)称取胃蛋白酶加入到胶原溶胀液中，鼠尾腱与蛋白酶质量比为50∶1～100∶1，在4℃，48～74小时酶解，期间间歇性搅拌；(5)将黏稠的胶体溶液进行高速冷冻离心处理，收集上清液；在冰水浴中，用的3～6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4℃沉淀10小时，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀；(6)用0.03～0.06mol/L的柠檬酸溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中，调节pH＝6.5，用的3～6mol/L的NaCl溶液缓慢加入上清液中，不断搅拌至溶液中白色的絮状物不再析出，4℃沉淀10小时，去除上清液，去除上清液，絮状溶液高速冷冻离心处理，收集沉淀；(7)用0.03～0.06mol/L的柠檬酸再次溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液，冰水浴中，调节pH＝6.5；溶液依次通过阳离子交换树脂、阴离子交换树脂进行脱盐处理；(8)将脱盐后的胶原蛋白溶液，‑40至‑20℃预冻2～4小时，然后真空冷冻干燥，冻干产品经进一步处理得到含水率在3％以下的胶原蛋白微粉，灭菌、包装，得到成品胶原蛋白粉末。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张志平，杨宁，
申请(专利权)人：黑龙江力海鑫生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23