本发明专利技术公开一种高温β-1,4-内切木聚糖酶和一种高温β-1,4-木糖苷酶的基因及其蛋白表达和应用。这两种酶的基因均来自热解纤维素菌Caldicellulosiruptor owensensis OL。高温木聚糖酶Co Xylanase A基因序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。高温木糖苷酶Co Xylosidase A基因序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。高温木聚糖酶能有效降解木聚糖为寡聚木糖，其最适反应温度为75℃，最适反应pH值为7.0，并在55-85℃，pH5.5-8.5均保持良好的反应活性。高温木糖苷酶能有效降解寡聚木糖为单糖，其最适反应温度为75℃，最适反应pH值为5.0，并在60-85℃，pH4.5-6.0均有良好的反应活性。两种酶协同作用,可将天然木聚糖高效降解为木糖，对半纤维素的工业应用具有潜在价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物质利用领域，具体涉及一种高温木聚糖酶基因和一种 高温木糖苷酶基因及其蛋白表达与应用。
技术介绍
： 半纤维素是自然界中数量最大、最重要的可再生利用的生物质之一。木聚糖是半 纤维素中最主要的组分。木聚糖结构复杂，主链由通过0-1，4-糖苷键连接的吡喃木糖 组成，并包含葡萄糖醛酸基、乙酰基，a-L-呋喃型阿拉伯糖基等侧链。木聚糖及其酶解产 物在食品、饮料、饲料、医药、化工、服装和造纸等领域具有广泛应用价值（M.P〇lizeli，A. Rizzatti，R.Montietal.2005)。尽管天然木聚糖的酶解得到广泛的重视，但酶协同作用 低、稳定性差等因素仍然限制了其应用。本专利技术涉及的高温厌氧菌C.owensensis0L能够 在高温环境下高效利用天然半纤维素为碳源（S.Blumer-Schuette,D.Lewis,R.Kellyet al. 2010)。本专利技术从C.owensensis0L中获得0 -1，4-木聚糖酶和0 -1，4-木糖苷酶基因， 并在进行大量重组表达。0 -1，4-木聚糖酶能够具有在高温条件下（75°C)将天然半纤维素 转化低聚木糖，0 -1，4-木聚糖酶和0 -1，4-木糖苷酶能够协同作用将天然木聚糖完全转 化成木糖。
技术实现思路
专利技术目的： 本专利技术的目的是弥补现有木聚糖降解技术的不足，提供一种高温木聚糖酶和一种 高温木糖苷酶的基因，包含基因的重组载体和重组工程菌，以及两种酶的蛋白表达和应用。 具体包括如下： 1、一种高温P-1，4-木聚糖酶CoXylanaseA的基因，其基因序列如SEQIDNO. 1 所不，其表达的蛋白的氣基酸序列如SEQIDNO. 2所不。 2、一种高温@-1，4-木糖苷酶(：〇乂71〇81(1&86 4的基因，其基因序列如5￡0 10 NO. 3所不，其表达的蛋白的氣基酸序列如SEQIDNO. 4所不。 3、本专利技术提供包含上述木聚糖酶基因的重组载体pET-28b-XylanaSeA和包含上 述木糖苷酶基因的重组载体pET-28b-XylosidaseA。 4、本专利技术提供包含上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A基 因及重组载体的重组菌，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)。 5、本专利技术提供制备上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A表 达和纯化的方法。6、本专利技术提供上述高温木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A在 酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的单独和协同应用，优选其在水解榉木木聚糖及其在 制备低聚木糖和木糖中的应用。 技术方案： 为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下： (1)高温木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA基因重组载体和 重组工程菌的构建。 提取热解纤维素菌C.owensensis的基因组，设计引物分别PCR扩增木聚糖酶Co XylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA的基因，再酶切连接到载体pET_28b上，转化大肠 杆菌ToplO感受态细胞，筛选并通过测序鉴定阳性重组载体，提取重组载体质粒，转化大肠 杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，获得还有重组载体的重组工程菌。 (2)上述高温木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA的蛋白纯化 和酶学活性测定。将获得的重组工程菌转接培养，IPTG诱导酶蛋白表达。通过超声波破碎细胞，高 速离心和Ni-NTAs印harose4B亲和层析分离纯化；然后通过SDS-PAGE电泳和分子筛鉴定 蛋白分子大小和聚合态，其中高温木聚糖酶CoXylanaseA以单体形式存在，高温木糖苷酶 CoXylosidaseA存在单体和聚体形式；最后浓缩，测定蛋白浓度，分析蛋白的酶学性质。 (3)上述高温木聚糖酶CoXylanaseA和木糖苷酶CoXylosidaseA对天然木聚 糖的应用。 称取并配制天然榉木木聚糖溶液，将溶液分为四组，一组为对照，一组加高温木聚 糖酶Co Xylanase A，一组加高温木糖苷酶Co Xylosidase A，一组合用上述两种酶，分别在 最适温度和最适pH范围内作用，然后取反应液，用薄层层析法定性分析天然木聚糖水解后 成分，并用对羟基苯甲酸酰肼（P_hydroxybenzoic acid hydrazide，PAHBAH)法测定还原糖 含量。有益效果：为克服现有技术的不足，本专利技术从高温噬厌氧菌C. owensensis的基因组 中获得一种高温木聚糖酶Co Xylanase A和一种高温木糖苷酶Co Xylosidase A的基因，并 通过克隆表达获得相关酶蛋白。高温木聚糖酶Co Xylanase A最适温度为75°C，在55-85°C 范围内保持较高活性，最适pH值为7. 0,在pH5. 5-8. 5范围内保持较高活性。高温木糖苷酶 Co Xylosidase A最适温度为75°C，在60-85°C范围内保持较高活性，最适pH值为5.0,在 pH4. 5-6. 0范围内保持较高活性。实验证明高温木聚糖Co Xylanase A能将天然木聚糖有 效降解为低聚木糖和少量木糖，而联合使用高温木糖苷酶Co Xylosidase A能显著提高木 糖含量。两种酶的单独或联合作用具有潜在的工业应用价值。【附图说明】 图1 :高温木聚糖酶CoXylanaseA和高温木糖苷酶CoXylosidaseA表达的 SDS-PAGE分析 其中：A高温木聚糖酶CoXylanaseA表达的SDS-PAGE分析（M为蛋白分子量标 准）B高温木糖苷酶CoXylosidaseA表达的SDS-PAGE分析(M为蛋白分子量标准） 图2:高温木聚糖酶Co Xylanase A和高温木糖苷酶Co Xylosidase A的 Superdex200层析和SDS-PAGE电泳图 其中：A高温木聚糖酶CoXylanaseAB高温木糖苷酶CoXylosidaseA 图3 :温度和pH对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响 其中：A为温度对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响B为pH对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响 图4 :温度和pH对高温木糖苷酶CoXylosidaseA活性的影响 其中：A为温度对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响B为pH对高温木聚糖酶CoXylanaseA活性的影响 图5:高温木聚糖酶Co Xylanase A和高温木糖苷酶Co Xylosidase A协同酶解 榉木木聚糖的薄层层析其中：1 标样（Xylose:Xl;Xylobiose:X2;Xylotriose:X3;Xylotetraose:X4) ;2 棒 木木聚 糖；3棒木木聚糖+CoXylanaseA;4棒木木聚糖+CoXylosidaseA;5棒木木聚 糖+CoXylanaseA+CoXylosidaseA)【具体实施方式】 实施例1 :高温木聚糖酶CoXylanaseA和高温木糖苷酶CoXylosidaseA重组 工程菌株的构建 细菌基因组DNA的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高温β‑1,4‑木聚糖酶Co Xylanase A的基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩业君，米朔甫，彭小伟，贾晓静，乔玮博，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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