本发明专利技术涉及一种麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括采用亲水作用色谱（HILIC）分析色谱柱对含有麦角硫因的样品进行高压液相色谱分析，所述色谱柱采用HILIC填料作为固定相，采用（80～95）∶（20～5）的乙腈-水（v/v）溶液作为流动相，所述溶液的pH为5.6～8.0，柱温为25～45℃。本发明专利技术还涉及麦角硫因的定量检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学技术、分析化学领域，涉及麦角硫因及其含量的测定方法。
技术介绍
麦角硫因化-Ergothioneine，EGT)是一种稀有的天然手性氨基酸类强抗氧化剂， 是一种独特的细胞生理保护剂，具有抗氧化，馨合金属离子，防止紫外福射W及调节生物能 量、基因表达、免疫系统等诸多功能。由于麦角硫因特殊的生物学功能和药理活性，如；对抗 炎症，防御神经组织退化，阻止铜引发DNA和蛋白质发生氧化损伤，抑制发育性缺陷，保护 肝脏等，并且人和动物摄入后不会产生任何的毒副作用，属于通常认为安全的（generally recognized as safe, GRAS)广品，因此，麦角硫因在医药、食品、保健品和化妆品等打业具 有广泛的应用前景。 麦角硫因的制备方法有化学合成法、天然生物提取法和生物合成法。食用覃菌深 层发酵生物合成麦角硫因具有产量高、成本低、易实现规模化生产及产品安全等优势。覃菌 发酵合成的麦角硫因绝大部分积累于菌丝体内，因此快速准确地检测菌丝体和发酵液中的 麦角硫因，对于麦角硫因的研究和生产都至关重要。 至今尚没有麦角硫因检测方法的标准。国内外基本采用高压液相色谱 技术测定麦角硫因，所用检测柱普遍为反相Ci8柱。化ynh N.D.Bao利用两根串联 的Symmet;ryaiield?Ci8柱（250mmX4. 6mm，5]im)定量测定从金针茹子实体中提 取的麦角硫因，使用的流动相是抑7. 3含有3%己膳和0. 1% H己胺的磯酸轴缓冲 液（Huynh N. D. Bao a,Yoichi Shinomiya b,Hiroaki Ikeda, et al.,Preventing discoloration and lipid oxidation in dark muscle of yellowtail by feeding an extract prepared from mushroom(Flammulina velutipes)cultured medium. Aquaculture，2009,doi:10. 1016/j. aquaculture. 2009.06. 042. )。N. Joy Dubost 采 用两根串联的Econos地ere Ci8柱（250mmX4. 6mm，5]im)分离检测从覃菌子实体中提 取的麦角硫因，使用的流动相是抑7. 3含有3%己膳和0. 1% H己胺的磯酸轴缓冲液 (N. Joy Dubost,BoxinOu,Robert B.Beelman. Quantification of polyphenols and ergothioneine in cultivated mushrooms and correlation to total antioxidant capacity. Food Qiemistry, 2007, 105:727-735.)。周念波使用 Hypersil ODS Ci8 柱（2 50mm X 4. 6mm，5 y m )测定从双抱茹子实体中提取的麦角硫因，所用流动相为己 膳-水（3 : 97, v/v)溶液(周念波，朱艳琴，殷勤红.高效液相色谱法测定双抱茹中 麦角硫因的含量.食品科技，2010, 35(10) : 271-272. )。Chih-Hung Liang 利用 化rospherlOOClS柱测定从杏鲍茹深层发酵的菌丝体中提取的麦角硫因，所用流动相为含 有 3% 己膳和 0. 1% H己胺的磯酸轴缓冲液（Oiih-Hung Liang, Ling-Yi Huang, Kung-Jui Ho, et al. Submerged cultivation of mycelium with high ergothioneine content from the culinary-medicinal king oyster mushroom Pleurotus eryngii (higher basidiomycetes)and its composition. International Journal of Medicinal Mus虹ooms，2013, 15 (2) : 153-164,）。姜文侠、刘埼和周涛建立的反相高压液相色谱检测方 法是；色谱柱为Agilent Eclipse XDB-Cis柱，两根串联使用，流动相为甲醇-水（1 : 99， v/v)溶液(姜文侠，刘埼，周涛.. CN201210392294.8.)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供另一种，本方法基于与反相Ci8色谱不 同的分离机理。本专利技术技术方案的特点在于采用亲水作用色谱（Hy化ophilic Interaction Liquid化romatography, HILIC)分析检测麦角硫因，所述高压液相检测方法的色谱条件如 下： 采用HILIC填料作为色谱分析的固定相，色谱柱规格250mmX4. 6mm ;检测波长 250~260皿，优选254皿；流动相为己膳-水溶液。 上述麦角硫因的高压液相检测方法，其中所述流动相为（80~95) : (20~5)的己 膳-水（v/v)，使用lOmmol/L~40mmol/L的己酸馈缓冲液调节流动相的抑至5. 6~8. 0， 优选（85~95) : (15~5)的己膳-水溶液（v/v)，lOmmol/L~25mmol/L的己酸馈缓冲液 调节流动相抑至6. 0~8. 0 ;柱温为25~45C，优选30~4(TC，最优选4(TC ;进样量及 流速分别根据样品浓度和上样量而定，记录时间为40min，麦角硫因的出峰时间在19min~ 25min。[000引本专利技术的麦角硫因的定量检测方法中，标准曲线的绘制及待测样中麦角硫因的定 量方法如下： 1)麦角硫因对照品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因对照品的溶 液； 2)对含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液分别进行本专利技术所述的高压液相色谱 检测； 3)根据麦角硫因对照品的浓度与相应的高压液相色谱峰面积绘制标准曲线；和 4)对麦角硫因待测样品进行本专利技术所述的高压液相色谱检测，根据检测结果的出 峰时间和峰面积，比照对照品的出峰时间和标准曲线，对待测样品中的麦角硫因的含量进 行定量。 其中，麦角硫因对照品的预处理步骤包括，精密称取一定量的麦角硫因对照品，用 纯水配制成一定浓度梯度的麦角硫因对照品溶液；经微孔滤膜过滤，即得含不同浓度的麦 角硫因对照品的溶液。上述微孔滤膜过滤步骤中选择孔径0. 1~0. 45 y m的微孔滤膜，优 选0. 22 y m孔径的微孔滤膜。 具体地，对含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液进行高压液相色谱检测的条件， 与上述的麦角硫因样品的高压液相色谱检测方法中使用的条件相同。 所述的系统适应性试验按照常规方法进行，包括检测限、定量限、精密度、重复性、 稳定性、回收率的考察。本专利技术的优势在于；首次采用HILIC色谱柱分析和检测麦角硫因，由于亲水色谱 是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术，通过采用强极 性固定相一高纯硅胶键合中性亲水醜胺基团，同时结合高比例有机相/低比例水相组成 的流动相来实现对强极性化合物的保本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括采用亲水作用色谱（HILIC）分析色谱柱对含有麦角硫因的样品进行高压液相色谱分析，所述色谱柱采用HILIC填料作为固定相，采用（80～95）∶（20～5）的乙腈‑水（v/v）溶液作为流动相，所述溶液的pH为5.6～8.0，柱温为25～45℃。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜文侠，刘琦，王洪宇，刘伟，李运华，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
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