本发明专利技术公开检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，特点是捕获探针为Fe3O4@β-CD、信号探针为胶体铂颗粒和多聚酶螯合物PV的复合物，其制备方法包括Fe3O4-NH2的制备步骤；捕获探针Fe3O4@β-CD的制备步骤；PtNPs的制备步骤；PtNPs/PV信号标签的制备步骤；免疫复合物的制备步骤；得到的免疫复合物中加入DAB的A液和B液各50µL，避光孵育15-30min，所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度，根据相应吸光值与莱克多巴胺浓度的关系描绘标准曲线，并根据该标准曲线确定待测样品中莱克多巴胺的浓度，优点是灵敏度高、选择性强、准确性高且检测速度快。
【技术实现步骤摘要】
检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术涉及莱克多巴胺检测技术，尤其是涉及一种基于Fe3O4@β-CD作为捕获探针、PtNPs/PV作为信号探针的用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
β2受体激动剂(β-adrenergicagonists)因可缓解哮喘症状,从而常被用作兽药；然而由于其能增长肌肉、减少脂肪蓄积等也常被添加到饲料中。莱克多巴胺(Ractopamine，RAC)作为β2受体激动剂的一员是一种人工合成的克仑巴安，正被作为一种新型瘦肉精在一些养猪场使用。我国农业部、卫生部、国家食品药品监督局联合发布的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中规定禁止莱克多巴胺作为生长促进剂在饲料中使用。因此，亟需一种快速、高灵敏的莱克多巴胺痕量残留检测方法作为保证食品安全的重要手段。目前，大量的检测手段已经研究并用于莱克多巴胺的检测，其中较精确可靠的如气相色谱(GC)、液相色谱(LC)以及它们与质谱联用(GC-MS、LC-MS)。但它们都存在仪器操作复杂、仪器昂贵、耗时长等问题，这些问题使得它们很难用于现场快速筛查。快速检测试纸条虽然方便但仅能做到定性，不能定量。同时，传统的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒一般使用竞争法，虽然快捷有效，但仍存在检测限太高、假阳性等缺点。目前国内外还没有公开任何关于利用Fe3O4@β-CD作为捕获探针、PtNPs/PV复合物作为酶标抗体用于检测莱克多巴胺的免疫比色法的相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、准确性和灵敏度高、特异性强且易于操作的用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板和信号探针，所述的酶标板内含有莱克多巴胺抗原和捕获探针Fe3O4@β-CD，所述的信号探针为负载了大量PtNPs的PtNPs/PV的复合物，标准品为莱克多巴胺标准品，抗体工作液为抗莱克多巴胺抗体单克隆抗体，显色液为DAB显色体系中的A液和B液，终止液为2MHCl或者2MH2SO4，洗液是PBST缓冲液。一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：(1)Fe3O4-NH2的制备将无水醋酸钠、己二胺(1,6-hexanediamine)和FeCl3·6H2O混合后加入到乙二醇中，于42-60℃条件下搅拌得到铁源溶液，将铁源溶液转移到马弗炉中，于195-205℃条件下反应6-8h后，用磁铁分离，再分别用水和乙醇冲洗2-3次，除去未完全反应的溶剂，得到粒径为15-25nm的Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒；(2)Fe3O4@β-CD的制备将羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)添加到含羧甲基化β-环糊精(carboxymethyl-β-CD，CM-β-CD)质量浓度为1wt％的PBS溶液(pH＝7.4)中，在室温下搅拌过夜后(以活化β-环糊精上的羧甲基)，再加入步骤(1)制备得到的Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒，连续搅拌5-7h后，用磁铁分离，再用去离子水反复清洗，以除去未反应的化学物质，得到的Fe3O4@β-CD；(3)PtNPs的制备将2ml1wt％的氯铂酸溶液加入到烧杯中轻搅4-6min后，迅速加入5ml10mmol/L的硼氢化钠溶液还原，室温下剧烈搅拌，反应结束后通过于10000-12000r/min离心15-25min除去杂质，水洗至少3次后定容至2ml得到PtNPs溶液，在4℃条件下保存备用；其中烧杯经王水浸泡；(4)PtNPs/PV复合物信号标签的制备将步骤(3)制备得到的PtNPs溶液在0-4℃(为了使PV酶加进去的时候温度不至于过高而使酶失活)下轻微搅拌5-10min，在搅拌条件下缓慢滴加等体积PV酶试剂(PowerVision，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，搅拌过夜后加入1wt％的牛血清蛋白溶液，于低温0-4℃保持2-6小时(封闭PtNPs上多余的键位)，即得到PtNPs/PV复合物溶液，在4℃条件下保存备用；(5)酶联免疫试剂盒免疫复合物的制备在酶标板的每孔中加入5mgFe3O4@β-CD和50μL系列稀释的莱克多巴胺的标准品(0.03、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ngmL-1)，50μL抗莱克多巴胺抗体溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液(含有0.05v/v％吐温的0.01molL-1pH7.2-7.4的PBS溶液)洗板3次，磁铁分离，然后每孔加入80μLPtNPs/PV复合物溶液，混匀后37℃避光孵育30min，PBST缓冲液洗板3次，磁铁分离，即得到莱克多巴胺ELISA检测试剂盒；其中莱克多巴胺标准品的稀释液为0.01molL-1pH7.2-7.4的PBS溶液(PBS磷酸盐缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司：0.01MpH7.2-7.4)。步骤(1)中无水醋酸钠、己二胺(1,6-hexanediamine)、FeCl3·6H2O和乙二醇的混合比例为4g：13g：2g：30ml。步骤(2)中羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、羧甲基化β-环糊精和Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒的质量比为1:1:2:1。在步骤(5)中得到的莱克多巴胺ELISA检测试剂盒的每孔中加入二氨基联苯胺(DAB显色液是莱克多巴胺检测试剂盒里面的药品，莱克多巴胺试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司，产品编号：HE09003)的A液和B液各50μL，避光孵育15-30min，所得到的DAB显色产物通过酶标仪测定吸光度。一种应用上述检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒检测莱克多巴胺浓度的方法，具体步骤如下：以Fe3O4@β-CD磁性纳米颗粒作为捕获探针捕获溶液中的莱克多巴胺(RAC)，采用非竞争性免疫的方法使捕获探针上的RAC特异结合所加入的抗体，通过洗板和磁性分离去除游离的抗体及其它游离物仅余固定在板底的抗体；再加入胶体铂标记PV与抗体特异结合，经孵育和洗板，留下莱克多巴胺抗原、抗体、胶体铂标记PV组成的免疫复合物，该免疫复合物的量随样品中莱克多巴胺的增加而增加，最后加入DAB显色，进行比色分析，以比色分析结果确定待测样品中莱克多巴胺的浓度。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用，PowerVision(PV)试剂是一种多聚酶螯合物，含有抗体和大量辣根过氧化物酶(HRP)，相较于传统酶标抗体，该试剂增加了单位抗体上标记的HRP酶，通过增加HRP酶含量的方法达到信号放大的目的。同时，铂胶体颗粒(PtNPs)对HRP催化底物二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)有很强催化效应，且该催化效果和PtNPs的添加量呈比例关系。并且，PtNPs合成步骤简单、颗粒稳定、有很强的生物相容性，能与酶蛋白结合且不会影响其催化效应，可用来负载蛋白酶。本专利技术使用β-环糊精(β-cyclodextrins，β-CD)作为捕获探针捕获样液中痕量的莱克多巴胺。β-环糊精作为一种主客体物质，其包合技术在药品和食品工业中应用愈加广泛，它能选本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板和信号探针，其特征在于：所述的酶标板固定有莱克多巴胺抗原和捕获探针Fe3O4@β‑CD，所述的信号探针为负载了大量 PtNPs 的 PtNPs/PV 的复合物，标准品为莱克多巴胺标准品，抗体工作液为抗莱克多巴胺抗体单克隆抗体，显色液A、显色液B为显色剂DAB，终止液为2M HCl或者2M H2SO4，洗液是PBST缓冲液。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)Fe3O4-NH2的制备将无水醋酸钠、己二胺和FeCl3·6H2O混合后加入到乙二醇中，于42-60℃条件下搅拌得到铁源溶液，将铁源溶液转移到马弗炉中，于195-205℃条件下反应6-8h后，用磁铁分离，再分别用水和乙醇冲洗2-3次，除去未完全反应的溶剂，得到粒径为15-25nm的Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒；其中无水醋酸钠、己二胺、FeCl3·6H2O和乙二醇的混合比例为4g：13g：2g：30ml；(2)Fe3O4@β-CD的制备将羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺添加到含羧甲基化β-环糊精质量浓度为1wt％的pH7.4的PBS溶液中，在室温下搅拌过夜后，再加入步骤(1)制备得到的Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒，连续搅拌5-7h后，用磁铁分离，再用去离子水反复清洗，以除去未反应的化学物质，得到的Fe3O4@β-CD；其中羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、羧甲基化β-环糊精和Fe3O4-NH2磁性纳米颗粒的质量比为1:1:2:1；(3)PtNPs的制备将2ml1wt％的氯铂酸溶液加入到烧杯中轻搅4-6min后，迅速加入5ml10mmol/L的硼氢化钠溶液还原，室温下剧烈搅拌，反应结束后通过于10000-12000r/min离心15-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘道东，陈淑贤，孙杨赢，曹锦轩，曾小群，吴振，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。