一种通过未受精胚珠培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过未受精胚珠离体培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法，其方法包括如下步骤：取黄瓜雌花开花前的完整子房接种在以MS培养基为基础添加TDZ的预培养培养基上进行初步诱导；初步诱导后将完整子房沿中心线纵切，剥离未受精胚珠接种在含有KT和BA的IM3诱导培养基上；待胚状体分化出子叶和胚根后，转入MS培养基中继续生长、发育，获得完整的再生植株；采用根尖细胞染色体计数和流式细胞仪鉴定其倍性，成功获得单倍体和二倍体植株。本发明专利技术不仅奠定了黄瓜单倍体育种的研究基础，更为杂交选育、分子标记、遗传图谱构建和基因定位提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种通过未受精胚珠培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法
本专利技术涉及植物组织培养领域，具体涉及黄瓜的组织培养和植株再生方法。
技术介绍
黄瓜(CucumissativusL.)是我国重要的保护地蔬菜作物，随着栽培面积逐年扩大，市场对黄瓜品种抗病性、耐逆性、产量和商品性的要求也日渐提高，但常规育种技术对黄瓜品质和抗病性选择效率不高，选育一个新品种一般需要6-8年时间。单倍体培养为缩短育种年限、提高育种效率提供了可能。由于获得的单倍体植株常常发生染色体自身加倍的现象进而形成双单倍体(DH)植株，因此不存在等位基因位点的显隐性作用，使隐性基因控制的性状也能获得充分体现，极大降低了筛选育种材料时的误选概率。利用单倍体诱导技术还能迅速获得个体完全纯合同质的DH群体，为遗传分析、分子标记和数量性状研究提供理想材料。虽然单倍体在育种和分子生物学基础研究及应用上都具有重要意义，但黄瓜自发产生单倍体的概率极低(Savinetal.,1988)，不能满足科研工作需要，所以研究者们往往通过雄核和雌核发育两个途径诱导单倍体发生，获得DH材料。在瓜类作物上，国内外学者多利用辐射花粉处理、延迟授粉和添加激素等方法诱导单倍体的发生进而获得DH材料，尽管有个别成功的报道，但胚发生频率仍然极低，且重复性差。在南瓜的雌核发育研究中就曾发现，尽管未授粉子房可以诱导发生胚状体，但其在分化过程中畸形率较高，不容易获得完整再生植株(孙守如等，2009)。目前，在黄瓜上多通过离体或活体雌核发育途径进行诱导，且采用的均是未授粉子房离体培养以及辐射花粉授粉诱导的孤雌生殖，但再生效果也都不甚理想，且在人工诱导过程中存在较严重的发育障碍。Gémes-Juhúsz(2002)首次通过雌核发育途径获得黄瓜单倍体植株，但胚诱导再生频率较低，方法繁琐，且没有报道植株再生频率和再生植株的倍性情况。魏爱民等(2007)研究了栽培方式和栽培季节对黄瓜未受精子房发育的影响，并证明保护地种植的供体材料单倍体发生率和成苗率均明显高于露地。杜胜利等(2001,2003)通过对黄瓜离体雌核发育过程的研究发现，外植体中的多种酶活性在诱导前期便产生了明显变化，同时进行解剖学观察，显示雌核发育已启动。此外，陈小鹏(2005)、王璐(2008)、刁卫平(2008)、王烨(2008)、裴晓利(2011a,2011b)和Li(2013)等还对基因型、培养基添加物、预处理等影响黄瓜单倍体发育的诱导条件和技术环节进行了研究和优化。但目前黄瓜雌核发育诱导植株再生研究仍然存在较多不足：首先，试验材料均为华北密刺类型和欧洲温室类型黄瓜的常规种和自交系，而对育种研究极为重要的欧亚杂交类型黄瓜尚未见到任何相关研究报道，因此给单倍体育种在黄瓜上的应用带来较大的局限性；其次，目前国内外黄瓜雌核发育相关研究虽然开展的较多，但均以未授粉子房为外植体，如前所述，胚在发育过程中容易受到子房壁组织等对其发育的影响，因此畸形率较高且不易获得完整再生植株；最后，由于当前的雌核发育多经过的是愈伤途径，少有直接成苗的胚状体途径，因此极易出现再生植株染色体倍性混杂等问题。而雌核发育的最终目的是获得纯合的双单倍体材料，倍性混杂的材料无法应用于育种和研究，因此也限制了单倍体研究的发展。至今尚未见到以欧亚杂交类型黄瓜为材料通过诱导未受精胚珠雌核发育获得胚状体和再生植株的研究报道。参考文献陈小鹏,刘栓桃,孙晓镭,赵智中,王秀峰.2005.黄瓜未受精子房的胚状体诱导研究初报.西北农业学报，14(2)：148–151.刁卫平，陈劲枫，雷春，宋慧，张晓青.2008.影响黄瓜未授粉子房培养胚发生因素的研究.南京农业大学学报，31(1)：137–140.杜胜利.2001.利用生物技术创造黄瓜育种新材料方法研究.天津科技，(2)：627.杜胜利,韩毅科,丛颖,魏爱民,候锋,陈启民.2003.黄瓜离体雌核发育的过程及其早期生化变化研究.南开大学学报(自然科学版)，36(2)：27–30.Gémes-JuhaszA,BaloghP,FerenczyAandKristófZ.2002.Effectofoptimalstageoffemalegametophyteandhearttreatmentoninvitrogynogenesisinductionincucumber(CucumissativusL.).PlantCellReports,21(2):105–111.LiJW,SiSW,ChengJY,LiJXandLiuJQ.2013.ThidiazuronandsilvernitrateenhancedgynogenesisofunfertilizedovuleculturesofCucumissativus.BiologiaPlantarum,57(1):164–168.潘莉，杨铁钊.2000.烟草未授粉子房胚状体诱导的研究.西北植物学报，20:59–63.裴晓利.2011b.黄瓜离体雌核发育诱导单倍体及其DH群体SSR标记图谱构建[硕士论文].兰州：甘肃农业大学..裴晓利,杨颖,李胜,王建设.2011a.黄瓜离体雌核发育诱导单倍体的研究.甘肃农业大学学报，46(6)：52–56.SavinF,DecombleV,LeCouviourM.,etal.1988.TheX-raydetectionofhaploidembryosariseninMuskmelonCucumismeloL.seeds,andresultingfromaparthenogeneticdevelopmentinducedbyirradiatedpollen.CurcurbitGenetCropRep,11:39–42.孙守如，翟庆慧，胡建斌，陈解放，章鹏.2009.几种生理因素对子房未授粉南瓜胚形成的影响.植物生理学通讯，10(45)：977–980.王璐，陈小燕，张力，陈怀勐，任华中.2008.不同因素对黄瓜未受精子房胚状体诱导的影响.西北农业学报，17(4)：267–270.王文和，吴禄平，赵玉萍，王超.2011.草莓未受精子房离体雌核发育的研究.园艺学报，38:1455–1461.王烨，顾兴芳，张圣平.2008.预处理和外源激素对黄瓜未授粉子房的胚状体诱导的影响.华北农学报，B06:50–53.魏爱民,韩毅科,杜胜利,张桂华,刘楠.2007.供体植株栽培季节和栽培方式对黄瓜未受精子房离体培养的影响.西北农业学报，16(5)：141–144.阎华，周嫦，杨弘远.1988.向日葵未受精胚珠培养中各种影响因素的实验研究.武汉植物学研究，6(4):319–327.杨江义，李旭锋.2002.植物雌性单倍体的离体诱导.植物学通报，19:552–559,574.
技术实现思路
针对现有技术的不足，创新的通过对欧亚杂交类型黄瓜未受精胚珠进行离体培养，通过对培养基成分和相关技术环节的研究，经雌核发育诱导植株成功再生。本专利技术提供的技术方案是：一种通过未受精胚珠离体培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法，其包括如下步骤：1、取黄瓜开花前雌花的完整子房接种在以MS培养基为基础添加TDZ的预培养培养基上进行初步诱导；2、初步诱导完成后，取出完整子房并沿中心线纵切，剥离未受精胚珠接种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过未受精胚珠离体培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取黄瓜开花前的雌花的完整子房接种在以MS培养基为基础添加TDZ的预培养基上进行初步诱导；(2)初步诱导完成后，取出完整子房并沿中心线纵切，剥离未受精胚珠，接种在含有KT和BA的诱导培养基上，其中添加0.5‑1.0mg·L‑1的KT和1.0‑4.0mg·L‑1的BA；优选为在培养基中添加0.75mg·L‑1的KT和2.0mg·L‑1的BA；(3)待胚状体分化出子叶和胚根后，转入MS培养基中继续生长、发育，获得完整的再生植株；(4)采用根尖细胞染色体计数和流式细胞仪鉴定其倍性。

【技术特征摘要】
1.一种通过未受精胚珠离体培养诱导雌核发育获得黄瓜再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)取黄瓜开花前的雌花的完整子房接种在以MS培养基为基础添加TDZ浓度为0.01-0.1mg·L-1的预培养基上进行初步诱导；(2)初步诱导完成后，取出完整子房并沿中心线纵切，剥离未受精胚珠，接种在以IM3为基础，添加0.5‐1.0mg·L‐1的KT和1.0‐4.0mg·L‐1的BA的诱导培养基上，其中诱导培养基pH5.5到5.7，IM3的成分如下：(3)待胚状体分化出子叶和胚根后，转入MS培养基中继续生长、发育，获得完整的再生植株；(4)采用根尖细胞染色体计数和流式细胞仪鉴定其倍性；所述黄瓜为欧亚杂交类型黄瓜。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述开花前的雌花是开花前的1-2天，初步诱导为7天。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王烨，顾兴芳，张圣平，苗晗，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11