本发明专利技术关注亲和力成熟的CRIg变体。具体而言，本发明专利技术关注具有提高的对C3b的结合亲和力且保留胜过C3的对C3b的选择性结合的CRIg变体。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】亲和力成熟的CRIg变体 本申请是申请日为2009年05月06日、中国申请号为200980116490. 9、专利技术名称 为"亲和力成熟的CRIg变体"的专利技术申请的分案申请。 专利
本专利技术关注亲和力成熟的CRIg变体。具体而目，本专利技术关注具有提尚的对C3b的 结合亲和力且保留胜过C3的对C3b的选择性结合的CRIg变体。 专利技术背景 补体系统 补体系统是由正常情况下以无活性的酶原形式存在的一系列血清糖蛋白构成的 复杂酶级联。三种主要途径，即经典、旁路和甘露糖结合凝集素途径，能活化补体，它们在C3 水平合并，其中两种类似的C3转化酶将C3切割成C3a和C3b。 巨噬细胞是已经发展出如下先天能力的专门细胞，即识别细胞表面表达的鉴定标 签的结构中的微小差异，所述的鉴定标签即所谓的分子样式（Taylor等，EurJImmunol 33,2090-1097(2003)Jaylor等，AnnuRevImmunol23,901-944(2005))。虽然这些 表面结构的直接识别是先天免疫的一个基础方面，但是调理作用容许通用巨噬细胞受体 介导吞食，提高效率和使吞细胞的识别全集多样化（Stuart和Ezekowitz,Immunity 22, 539-550 (2005))。吞食过程涉及多种配体-受体相互作用，而且现在清楚了多种 调理素（包括免疫球蛋白、胶原凝集素、和补体成分）经由与巨噬细胞表面受体的相 互作用来引导病原体内在化所需要的细胞活性（综述见Aderem和Underhi11，Annu RevImmunoll7，593-623 (1999);Underhill和Ozinsky，AnnuRevImmunol 20, 825-852(2002))。虽然由种系基因编码的天然免疫球蛋白能识别极其多种病原体，但是 大多数调理性IgG是经由适应性免疫生成的，而且因此经由Fc受体的高效清除不是立即的 (Carroll,NatImmunol5,981-986(2004))。另一方面，补体快速识别病原体表面分子并使 微粒准备好由补体受体来摄取（Brown,InfectAgentsDis1,63-70(1991))。 补体由30种以上的血清蛋白质组成，它们调理极其多种病原体，用以被补体受 体所识别。取决于级联的初始触发，可区别三种途径（综述见Walport,NEnglJMed 344, 1058-1066 (2001))。所有这三种途径共享活化中枢成分C3的共同步骤，但是它们依据 识别的本质和导致C3活化的初始生化步骤而不同。经典途径如下活化，抗体结合至病原体 表面，其继而结合Clq补体成分，引起一系列蛋白酶级联，最终将C3切割成其活性形式C3b。 凝集素途径在碳水化合物基序受到凝集素蛋白质识别后被活化。至今，已经鉴定了此途径 的三个成员：结合甘露糖的凝集素（MBL) ,SIGN-Rl凝集素家族和ficolin(Pyz等，AnnMed 38, 242-251 (2006))。MBL和ficolin都与丝氨酸蛋白酶有关，其像经典途径中的Cl那样 起作用，活化成分C2和C4,导致中枢C3步骤。旁路条件与经典条件和凝集素途径二者形 成对照，即它是由于内部C3酯与病原体表面上的识别基序的直接反应而被活化的。经由旁 路途径蛋白酶因子B和因子D的作用，初始C3结合活化性表面导致C3b沉积的快速扩大。 重要的是，经由因子B和D的作用，通过经典途径或凝集素途径任一所沉积的C3b也能导致 C3b沉积的扩大。在补体活化的所有三种途径中，调理中的关键步骤是成分C3转化成C3b。 补体级联的酶对C3的切割将硫酯暴露于亲核攻击，容许C3b经由硫酯结构域共价附着到抗 原表面上。这是补体调理中的初始步骤。对所结合的C3b的后续蛋白水解生成iC3b、C3c 和C3dg，即受到不同受体识别的片段（Ross和Medof,AdvImmunol37,217-267(1985))。 此切割消除了C3b进一步扩大C3b沉积和活化补体级联晚期成分（包括能够指导膜破坏 的膜攻击复合物）的能力。然而，巨噬细胞的吞噬细胞受体优先识别C3b及其片段；由于 醋键形成的通用性，C3介导的调理对于病原体识别是重要的（Holers等，ImmunolToday 13, 231-236 (1992))，而且各种C3降解产物的受体因此在宿主免疫应答中发挥重要作用。C3自身是由13个独特结构域组成的复杂的且有柔性的蛋白质。该分子的核心由 8个所谓的巨球蛋白（MG)结构域构成，它们构成了C3的紧密压缩的a和0链。插入此 结构的是CUB(Clr/Cls、Uegf?和骨形态生成蛋白-1)和TED结构域，后者含有容许C3b与病 原体表面共价结合的硫酯键。剩余结构域含有C3a，或者作为核心结构域的接头和间隔物 起作用。C3b和C3c结构与C3的比较证明了该分子在每次蛋白水解时经历重大构象重排， 不仅暴露TED，而且暴露了该分子的能与细胞受体相互作用的别的新的表面（Janssen和 Gros,MolTmmun〇1 44, 3-10 (2007))〇 吞噬细朐h的补体C3#体 有三个已知的补体受体基因超家族：短共有重复（SCR)模块（其编码CRl和CR2)， 0-2整联蛋白家族成员CR3和CR4,及免疫球蛋白Ig超家族成员CRIg。 CRl是由30个短共有重复（SCR)组成的180-210kDa糖蛋白，在免疫复合物清 除中发挥主要作用。SCR是约60个氨基酸的模块结构，每个有两对二硫键，提供结构刚 性。对C3b和C4b二者的高亲和力结合经由两个独特位点发生，每个由3个SCR构成 (综述见Krych-Goldberg和Atkinson,ImmunolRev180, 112-122 (2001))。CRl的SCR 15-17内所包含的C3b结合位点（位点2)的结构已经通过MRI测定（Smith等，Cel1 108, 769-780 (2002))，揭示了三个模块处于延伸的头对尾排列中，在16-17连接处有柔性。 结构指导的诱变鉴定了模块15上对C4b结合至关重要的一个带正电荷的表面区域。此片与 CRl同一面上暴露的模块16的碱性侧链一起是C3b结合所需要的。CRl的主要功能，首先描 述为免疫粘附受体（Rothman等，JImmunol115, 1312-1315(1975))，用以捕捉红细胞上的 1C，供转运和通过肝的清除（Taylor等，ClinImmunolImmunopathol82, 49-59 (1997)) 〇 嗜中性细胞上的CRl在吞噬中有作用，但是在组织巨噬细胞中不然（Sengelov等，J Immunol153,804-810(1994))。在其在免疫复合物清除中的作用之外，经由其与相应转 化酶的相互作用，CRl是经典途径和旁路途径二者活化的有力抑制剂（Krych-Goldberg和 Atkinson, 2001，见上文；Krych-Goldberg等，JBiolChem274,31160-31168(1999))。在 小鼠中，CRl和CR2是同一基因通过可变剪接形成的两种产物，主要与B淋巴细胞和滤泡树 突细胞有关，且主要在调节B细胞应答中发挥功能（Molina等，199本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种CRIg变体，其包含在选自下组的区域中的氨基酸替代：SEQ ID NO:2之氨基酸序列的E8‑K15，R41‑T47，S54‑Q64，E85‑Q99和Q105‑K111。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：萨科德夫·S·西多，李冰，曼诺·范卢克伦坎帕格尼，克里斯琴·威斯曼，
申请(专利权)人：健泰科生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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