减少糖蛋白聚集的方法技术

本发明专利技术提供了通过优化O-连接的糖基化位点的数量，减少糖蛋白聚集的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了通过优化O-连接的糖基化位点的数量，。【专利说明】 本申请全文中参考了多种出版物。这些出版物的公开内容以其整体通过引用并入 本申请，以更完整地描述本专利技术所涉及的现有技术的状态。 专利
本专利技术涉及通过优化〇-连接的糖基化位点的数量，。 专利技术背景 蛋白糖基化是决定生物制剂的功效和药代动力学长效的重要质量属性。理解每个糖基 化位点如何影响蛋白质的整体功能有助于优化最终产品质量。通过达到均质的糖基化谱， 可实现产量的增加并确保产品的可比性。 0-连接的糖基化是指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖，或木糖中的一种糖连接到羟基 氨基酸，最通常是丝氨酸或苏氨酸。〇-连接的糖残基具有的结构规则少于N-连接的糖基 化，并且因此产生更大的糖型多样性。由于缺少共有的识别序列，〇-连接糖基化是难以预测 的。然而，已开发出神经网络方法以更好地预测粘蛋白型0-连接的位点（Julenius，K等 人，2005. 15，153-164)。尽管迄今为止的大多数报道记载了 0-多糖在糖 蛋白结合能力或掩蔽其肽骨架中的作用，一个具体案例研宄证实了具有更多〇-连接的位 点的促卵泡激素（FSH)类似物的生物活性低于具有更多N-连接的糖基化位点的FSH类似 物（Weenen, C.等人，2004. /C/iz?你5204-5212)。已经显示 0-连 接的多糖对于糖蛋白gC-1的细胞表面表达是非必需的，但可干扰其表位的结合结构域及 其结合能力（Biller, M.等人，2000. 67_^〇/^〇7〇灯 10，1259-1269)。 认为糖基化的存在影响商业生物制剂的免疫原性、功效、溶解度和半衰期（Lis， H.等人，1993?及/r / 218，.Xcme，].丛?等尺，2QQ3.AnnuRevBiochem12, 643-691 ;Van den Steen, P.等人，1998. frit Tfer 沿ocAe? #〇/ 沿33，151-208)。然 而，大多数文献集中于N-连接糖基化的影响（Hossler, P.等人，2009. 19， 936-949)。缺乏关于0-连接的糖基化对蛋白质量的影响的信息，特别是关于蛋白聚集的信 息。 蛋白治疗剂在制造期间的聚集是不期望的，并且需要密集的下游加工以将其去 除。因此，需要使蛋白聚集最小化，导致生产成本降低和加速的工艺过程优化。0-连接的糖 基化与治疗性糖蛋白的聚集之间的关系的发现使得制造者能够在产品开发早期改进所述 治疗性糖蛋白。
技术实现思路
本专利技术提供了通过优化0-连接的糖基化位点的数量，。所 述糖蛋白可以是融合蛋白。所述融合蛋白可包含人免疫球蛋白的Fc区的铰链部分。所述 人免疫球蛋白可以是人IgG。 本专利技术提供了，其包括消除其中一个或多个0-连接的糖 基化位点。待消除的0-连接的糖基化位点可以在Fc结构域的铰链区中。 本专利技术提供了，其包括通过氨基酸取代和/或删除消除一 个或多个〇-连接的糖基化位点。所述一个或多个取代和/或删除的〇-连接的糖基化位点 可以在SEQ ID N0:5中所示的Fc结构域的铰链区中。在SEQ ID N0:5中所示的Fc结构域 的铰链区中的可消除的〇-连接的糖基化位点选自S248、T252、T254。所述一个或多个取代 和/或删除的〇-连接的糖基化位点可以在SEQ ID N0:4中所示的突变的Fc结构域的铰链 区中。在SEQ ID N0:4中所示的Fc结构域的铰链区中的可消除的0-连接的糖基化位点选 自 S129、S130、S136、S139、T133、T135。 本专利技术提供了图6中所示的CTLA41 g融合糖蛋白，包含消除选自S129、S130、S136、 S139、T133、T135的至少一个0-连接的糖基化位点。 附图简述 图1A-1C显示了 belatacept中的糖基化位点。A显示了从公布的数据（AMA 2008; Schwartz等人，2001)推导的，N-连接的糖基化和0-连接的糖基化位点。B显示了通过对 胰蛋白酶肽片段的质谱分析绘制的0-连接的糖基化位点（SEQ ID N0:3)。一个0-连接 的位点不能明确地确定为S129或S130。C显示了通过神经网络方法Net0Glyc3. 1预测的 〇-连接的糖基化位点（SEQ ID N0: 4)。将图6中所示的belatacept氨基酸序列用作在线 的 Net0Glyc3. 1 软件（www. cbs. dtu. dk/services/netoglyc)的输入物。 图2显示了在推定的0-连接位点与总唾液酸含量之间没有关联。在三个突变体 中没有0-连接的糖基化时，检测到一致的总唾液酸化（由虚线圈起）。 图3A-3D鉴定了在隐藏位点的0-连接的糖基化。A是说明共同的0-多糖结构的 图表。括号中的数字是分子量。Gal -半乳糖；GalNAc - N-乙酰半乳糖胺。B是显示野生 型belatac印t中的0-连接的糖基化的解卷积质谱。C是显示不具有S129、S130和S139的 突变体中的〇-连接的糖基化的解卷积质谱。在S129、S130和S139的三重删除后，突变体 中T133、T135和S136的0-连接糖基化更为可测。D是显示不具有S129、S130和S139并 且其中T133、T135和S136被丙氨酸取代的突变体中没有0-连接的糖基化的解卷积质谱。 图4A-4C显示了通过在相同位点的单突变的可变0-糖型的形成。A是显示具有 S129删除的突变体中的0-连接的糖基化的解卷积质谱。B是显示具有129位的谷氨酰胺 取代的突变体中的〇-连接的糖基化的解卷积质谱。C是显示具有完整S129和在130、133、 135、136和139位的丙氨酸取代的突变体中没有0-连接的糖基化的解卷积质谱。 图5显示相对于突变的0-连接位点，高分子量（HMW)种类的百分比的降低；数据 对野生型对照标准化至100%。有6个潜在的0-连接位点，并且产生突变体以消除一个至所 有六个糖基化位点。 图6 (SEQ ID NO: 1和2)描述了 belatacept的核昔酸和氛基酸序列，belatacept 是细胞毒性T-淋巴细胞抗原4 (CTLA4)融合蛋白，其包含信号肽（-1位的丙氨酸至-26位 的甲硫氨酸）；起始于+1位的甲硫氨酸并终止于+124位的天门冬氨酸，或起始于-1位的 丙氨酸并终止于+124位的天门冬氨酸的突变的CTLA4细胞外结构域；在+125位的谷氨酸 接头；和在+126至+357位的人免疫球蛋白G1抗体的Fc结构域的铰链-CH2-CH3结构域。 SEQ ID NO: 1和2分别描述了 belatac印t的核苷酸和氨基酸序列，包含26个氨基酸的信 号肽的CTLA4融合蛋白；起始于+27位的甲硫氨酸并终止于+150位的天门冬氨酸，或起始 于+26位的丙氨酸并终止于+150位的天门冬氨酸的突变的CTLA4细胞外结构域；在+151位 的谷氨酸接头；和在+152至+383位的人免疫球蛋白G1抗体的Fc结构域的铰链-CH2-CH3 结构域。 专利技术详述 除非另有说明，否则本申请中使用的所有科学和技术术语具有在本领域中通常使用的 含义。如本申请中所使用的，以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种减少糖蛋白聚集的方法，包括消除其中一个或多个O‑连接的糖基化位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱月明，SF哈塔克，李正剑，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：美国;US