一株产耐高温角蛋白酶的地衣芽孢杆菌UTM107 及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株产耐高温角蛋白酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)UTM107及其应用。该菌生物保藏编号为CGMCC No.9678。UTM107菌株可在下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体及畜禽粪便等废弃物中进行好氧堆肥发酵，在发酵过程中温度可达80～90℃，最高可达100℃以上，并长时间维持高温，能有效分解废弃物中的有机物。采用本发明专利技术的菌株制备的生物肥料绿色环保、性能优良，用其处理有机固体废弃物可做到无害化、减量化、资源化。应用本发明专利技术所制备的生物肥料绿色环保、性能优良。

【技术实现步骤摘要】
一株产耐高温角蛋白酶的地衣芽孢杆菌UTM107及其应用
本专利技术涉及城乡有机固体废弃物治理领域，涉及一种含角蛋白酶基因的地衣芽孢杆菌UTM107菌株及其在城乡有机固体废弃物处理中的应用。
技术介绍
我国每年城镇产生的生活污泥约8000万吨，并以5％的速度增长。城镇生活废水经处理后产生大量的污泥，其处理方式目前以脱水后填埋为主。在大量耗能污染空气的同时，占用大量的土地，还可能造成周边环境与地下水资源的污染。另外目前我国畜禽养殖业生产能力已居世界第一，畜禽养殖和加工过程中所产生大量的有机废弃物，在某些地区已成为大于工业污染的污染源。因此，采用更有效的方法对城乡生活污泥、餐厨垃圾、畜禽养殖与加工产生的废弃物以及农业生产产生废弃物进行更合理的处理，真正做到无害化、减量化和资源化很有必要。微生物发酵法是微生物利用有机废弃物中的营养物质，在适宜的温度水分等条件下利用有机物大量生长繁殖的同时产生的多种酶将有机大分子变成更小更简单分子，使各种复杂的有机态养分，转化为可溶性易吸收的养分和腐殖质。接种外源微生物能够在堆肥中形成优势菌群，有明显的促进堆肥腐熟的功能。堆肥好氧发酵技术是目前处理有机固体废弃物的有效方法，其占地少、技术简单、易操作、易推广、处理成本低。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是一种常见的土壤微生物类群，能分泌多种酶，能快速分解和利用多种有机物。将地衣芽孢杆菌应用于有机固体废弃物的处理，具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产耐高温角蛋白酶的地衣芽孢杆菌UTM107菌株及其应用。本专利技术从采自云南腾冲温泉的底泥，利用驯化培养基(牛肉膏5g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、可溶性淀粉15g、蒸馏水1000ml)在50℃经多代富集驯化，定向筛选出UTM107菌株。本专利技术提供的UTM107菌株为G+、细胞0.8×(2.5～3.5)μm、直杆状、单生、产生近中生椭圆芽孢，孢囊稍膨大；在含葡萄糖蛋白胨琼脂的培养基(葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠5、琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7.0)上菌落光滑正园、微突、蛋壳黄色、生长迅速，30～50℃培养24小时后菌落直径约2～3mm，最适生长温度40～70℃。利用引物为(27f)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和(1492r)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′经PCR扩增该菌株的16SrRNA基因，测序后的基因序列见序列表SEQIDNo:1，将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM107菌株的该基因与Bacilluslicheniformis的相似性最高，为99.7％，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。利用通用引物UP-1S:5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’和UP-2Sr:5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序后的基因序列见序列表SEQIDNo:2。获得的序列提交到NCBIGenBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTM107菌株的gyrB基因序列与Bacilluslicheniformis相似性最高，结合所述菌株的生理生化特性为鉴别该菌株的次要特征。确定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。菌株UTM107已于2014年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，保藏号为CGMCCNo.9678。本专利技术的地衣芽孢杆菌菌株UTM107，其能够产生耐高温角蛋白酶，尿囊素酶，纤维二糖酶和β-葡聚糖内切酶，因此具有耐高温角蛋白酶、尿囊素酶、纤维二糖酶、β-葡聚糖内切酶活性，其编码基因分别如序列表SEQIDNo:3～6所示。本专利技术提供了含有地衣芽孢杆菌UTM107的菌剂。本专利技术提供了地衣芽孢杆菌UTM107或其菌剂在有机固体废弃物的生物降解过程中的应用。本专利技术还提供一种制备含地衣芽孢杆菌UTM107的堆肥接种剂的方法，包括以下步骤：(1)制备发酵液：将地衣芽孢杆菌菌株UTM107接种于LB液体培养基中，进行发酵；(2)发酵液经脱水干燥得到粉末状菌剂。上述方法中，步骤(1)是将地衣芽孢杆菌UTM107接种于内装LB培养基的摇瓶中，培养温度35～50℃，摇床转速100～250转/分钟，培养时间24～48小时，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于内装LB培养基的种子罐中，培养温度35～50℃、搅拌转速200转/分钟、通气量1:0.4(v/v)、培养时间30～40小时，得到种子罐种子液；将种子罐种子液接种于内装LB培养基的发酵罐中，培养温度35～50℃、搅拌速度60～200转/分钟、通气量1:0.5(v/v)、接种量0.05％～5％、培养时间24～40小时，当OD600≥1.8时停止培养，得到UTM107的发酵液。优选地，制备摇瓶种子液的条件为：培养温度40℃，摇床转速150转/分钟，培养时间36小时。制备种子罐种子液的条件为：培养温度35～50℃、搅拌转速100～400转/分钟、通气量1:0.4(v/v)、培养时间36小时。优选地，将种子罐种子液接种于内装LB培养基的发酵罐中，培养温度40℃、搅拌速度100转/分钟、通气量1:0.5(v/v)、接种量2％、培养时间30小时。本专利技术提供了地衣芽孢杆菌菌株UTM107或含有其的菌剂在有机固体废弃物堆肥发酵中的应用。所述有机固体废弃物为下水污泥、生活垃圾、作物秸秆、动物尸体或畜禽粪便中的一种或多种。用地衣芽孢杆菌菌株UTM107或含有其的菌剂对有机固体废弃物进行堆肥的方法，包括以下步骤：(1)将相当于总物料湿重0.1％～1％的UTM107或其菌剂接种于有机固体废弃物中，混合拌匀，进行堆肥好氧发酵；所述有机固体废弃物物按碳氮比为10～50：1，含水率为45％～65％，保持氧气含量为8％～15％进行堆肥发酵，间隔3～5天翻抛1次；(2)堆肥12-20天，待物料水分降至28～33％，发酵终止。上述堆肥方法中，步骤(2)堆肥好氧发酵过程中，发酵3～4天时堆体温度达70～80℃，6～15天温度保持在80～90℃，最高温度可达105℃。约经12-20天的好氧发酵物料水分降至28～35％，废弃物中的大部分有机物被分解，终止发酵。剩余物或被填埋或被焚烧或过筛分装得生物肥料。本专利技术是从温泉的底泥中分离到一株具有高温角蛋白酶、尿囊素酶、纤维二糖酶、β-葡聚糖内切酶等活性的菌株，为处理有机固体废弃物提供了一种高效降解的手段。本专利技术菌株UTM107可以用于城市生活污水厂的下水污泥、生活垃圾、餐厨垃圾、动物尸体及畜禽粪便等废弃物的堆肥好氧发酵中，以治理废弃物造成的污染，并可以制备生物肥料，具有较好的社会效益和经济效益。附图说明图1菌株UTM107系统进化树。图2菌株UTM107的显微镜照片。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换本文档来自技高网...

【技术保护点】
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株UTM107，其保藏编号为CGMCC No.9678。

【技术特征摘要】
2014.12.24 CN 20141081480111.地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株UTM107，其保藏编号为CGMCCNo.9678。2.含有权利要求1所述地衣芽孢杆菌菌株UTM107的菌剂。3.一种制备含权利要求1所述地衣芽孢杆菌UTM107的堆肥接种剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备发酵液：将地衣芽孢杆菌菌株UTM107接种于LB液体培养基中，进行发酵；(2)发酵液经脱水干燥得到粉末状菌剂。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)是将地衣芽孢杆菌UTM107接种于内装LB培养基的摇瓶中，培养温度35～50℃，摇床转速100～250转/分钟，培养时间24～48小时，得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于内装LB培养基的种子罐中，培养温度35～50℃、搅拌转速100～400转/分钟、通气量1:0.3～0.6、培养时间30～40小时，得到种子罐种子液；将种子罐种子液接种于内...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永跃，何璧梅，许宜北，汪涌，
申请(专利权)人：大地绿源环保科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11