一株多粘类芽孢杆菌菌株制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004。所述菌株已于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504。所述菌株不仅对荔枝霜疫霉菌和/或炭疽病菌均具有非常好的抑制作用，还能够抑制荔枝或者龙眼的多酚氧化酶（PPO）和/或过氧化物酶（POD）的活性。因此，该菌株在荔枝或龙眼等果蔬的保鲜方面具有非常重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一株多粘类芽孢杆菌菌株
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一株多粘类芽孢杆菌菌株。
技术介绍
新鲜果蔬从采收到被消费者食用前，由于自身呼吸作用及病原生物侵染，每年都有大量果蔬从采收后在运输、贮藏过程中腐烂损失。国家农产品保鲜工程技术研究中心调查研究发现，目前我国每年年产的果蔬从田间到餐桌损失率高达25～30%，年损失近800亿人民币。与此同时，随着生活水平的提高，人们对水果等食品的要求越来越高，在对于水果的色、香、味要求基础上，人们越来越多地开始关注的是食品的安全与环保。因此进一步开展果蔬保鲜技术开发研究，以保证果蔬产品附加值的实现和资源的充分利用刻不容缓。目前国际通用的水果保鲜方法大致有两种：一种是乙烯吸收剂，通常是用透气袋来吸收乙烯，使水果不会进一步成熟，无药无害，但是保鲜时间和效果不稳定；另一种是打蜡，很多水果自身会产生果蜡，可防病虫、微生物侵害，但储存、运输时果蜡容易被蹭掉部分，效果不能保证，而且不可避免地导致消费者食用到果蜡，危害健康。另外，适量的二氧化硫对荔枝、龙眼等水果有很好的保鲜效果，但过量使用导致残留超标，不但果品品质受影响，食用者也会出现头晕、恶心、呕吐和腹泻等症状，甚至会损伤肝肾功能。有报道称控制果蔬采后病害的最有效手段是冷藏结合化学杀菌剂处理。但由于化学杀菌剂残留危害人类健康，而且植物病原菌对化学杀菌剂容易产生抗药性，应用越来越受到限制。以人们喜爱的岭南佳果荔枝为例，荔枝果实营养丰富，其色、香、味具佳，具有“果王”的美称，极具开发价值，具有很好的经济效益，是我国在国际市场上最具竞争力的水果之一，我国是目前世界上栽培荔枝最多的国家。但荔枝很难保存，针对荔枝的保鲜，素有“一日色变，二日香变，三日味变，四日色香味尽去”的总结。荔枝的果实采摘季节处于短暂且炎热的夏季，采后自身呼吸作用旺盛，水分蒸发率高，在自身酶及外界病原菌侵袭的双重作用下极易褐变腐烂，不易贮藏，不耐贮运，严重限制了荔枝的远销与出口，制约了地域市场的开拓。据统计，荔枝每年因腐烂变质而造成的损失约占总产量的20%以上。目前，国内外荔枝果实的贮藏保鲜技术主要有物理贮藏和化学保鲜两种。荔枝果实的化学保鲜过程中常用防腐药物主要是苯来特、特克多、施保克、灭菌威、多菌灵等，如申请号为CN200610123793.1、CN03140439.1、CN201010127794.X等专利；此外还包括熏硫或亚硫酸盐处理等化学处理方式，例如申请号为CN96122329.4、CN97105377.4以及CN00130815.7等专利。虽然化学药剂能比较有效的起到防腐、保鲜的作用，但其所产生的残留污染不仅影响风味，而且最重要的是药剂残留对人体健康有潜在威胁。化学保鲜剂屡屡触动备受食品安全问题煎熬的消费者神经。加之喷酸荔枝、石灰芒果等报道见诸报端和网络，不断地引发消费者的不安。寻找安全无毒的生物保鲜技术，用于取代化学保鲜法，已经成为关注的热点。微生物种类丰富、代谢途径多样，并能产生对自然界病害菌有拮抗作用的活性物质。因此，利用微生物及其制剂来进行水果保鲜，能达到无毒、无害、无残留、无污染的要求，安全有效地消除化学药剂的残留，符合食品安全的发展趋势。多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）是土壤中常见的细菌，也是一类重要的病害生物防治微生物，有不少还具有刺激植物生长的特点。大量研究表明，多粘类芽孢杆菌除了可以直接抑制植物病原菌，还能通过产生抗菌物质如抗菌蛋白质或酶、诱导寄主的抗病能力等。对于多粘类芽孢杆菌诱导寄主的抗病能力机制的研究越来越受到重视，2004年童蕴慧等公开了利用多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）W3菌株处理番茄叶片，能够明显增强植株叶内苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，对灰霉病有明显的诱导抗病作用。也就是说现有的多粘类芽孢杆菌可以直接抑制植物病原菌，同时增强寄主的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性。而本领域公知常识，抑制相关病菌对果蔬的保鲜具有正向作用，而促进POD、PPO酶类的活性对果蔬的保鲜具有反向作用，因此目前尚未见有多粘类芽孢杆菌应用于果蔬保鲜的研究和报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有荔枝或龙眼等果蔬采后生物保鲜技术的缺陷和不足，提供了一株新的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）菌株，该菌株不仅对炭疽病和荔枝霜疫霉病具有显著的抑制作用，而且能够抑制荔枝或龙眼的多酚氧化酶和/或过氧化物酶的活性，为果蔬的生物保鲜
提供了一个有效的新菌株。本专利技术另一目的是提供一种上述新菌株的制备方法，以及用于培养上述新菌株的改良LB液体培养基。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）菌株dgnkzx004，所述菌株于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCCM2014504。所述中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武汉大学。本专利技术人从东莞农业科学研究中心果园土壤中采集到所述菌株。具体地，在荔枝果园，选用对角线法和棋盘法采样。确定取土地点后，除去上面的枯枝落叶层以及地表5cm左右的浮土；之后用铲斜向下（离地表5～15cm深度的土壤）切取一片片的土壤样品。每个取样点取5～15个样，将取好的土样在灭菌牛皮纸上混合，四分法获取所需土壤的量。编号，记录采集信息：每一采样地的采集地点、采集日期、采集深度等。将各采样点混合土样各称取10g，放入盛有100mL无菌水（制备1：10土壤悬液）并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合并分散，此为原稀释液；再用1mL无菌吸管吸取1mL稀释后的土壤溶液注入盛有9mL无菌水的试管中，用吸耳球多次吹吸充分混匀，此为10-1稀释悬液；依次类推将土样梯度稀释成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的土壤稀释悬液，重复3次。多次吹吸混匀所制备好的稀释液，取10-2、10-4、10-6三个梯度的稀释液，用无菌移液管吸取（吸取前再次吹吸，确保稀释液均匀）0.2mL加到已凝固的LB平板上，然后用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化并进行革兰氏染色镜检。本专利技术还提供了所述菌株的最适改良LB液体培养基，上述LB平板就是由改良LB液体培养基加入琼脂制备而成；所述改良LB液体培养基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000mL，pH6.8，121℃灭菌20min。本专利技术还提供了一种所述菌株dgnkzx004的培养方法，使用上述改良LB液体培养基作为培养基，具体步骤如下：S1.菌株的活化：将多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的甘油菌种按体积比2%的接种量接种到改良LB液体培养基中，32℃静置活化培养20小时，得种子液；S2.扩大培养：将种子液按体积比5%的接种量接种到改良LB液体培养基中，并于32℃静置培养20小时，得发酵液；S3.菌体悬液制备：发酵液经离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体，最后用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004，其特征在于，所述菌株于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2014504，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）菌株dgnkzx004，其特征在于，所述菌株于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCCM2014504，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形态为圆形，奶油白色，表面干燥不透明，凸起生长，湿润，边缘整齐，直径1.3～1.7mm；显微镜观察菌体形态为革兰式阳性菌，杆状。3.一种权利要求1或2所述菌株dgnkzx004的培养方法，其特征在于，步骤如下：S1.菌株活化：将多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的甘油菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：马锞，徐匆，范妍，胡珊，李艳芳，胡文锋，罗华建，罗诗，
申请(专利权)人：东莞市农业科学研究中心，胡文锋，
类型：发明
国别省市：广东;44