本发明专利技术提供一种化妆品检测，本发明专利技术应用组织工程方法，以聚碳酸脂膜为支架，以人皮肤角质形成细胞为细胞来源，构建组织工程表皮模型，经检测HE染色、免疫荧光染色及透射电镜观察显示，构建的组织工程表皮模型分化良好，具有与正常表皮相似的结构：基底膜、棘层、颗粒层和角化层。组织工程表皮模型的IC50值为0.183%。在聚碳酸酯膜上构建的组织工程表皮模型具有与正常表皮相似的组织结构，并且具有一定的屏障功能。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种化妆品检测，本专利技术应用组织工程方法，以聚碳酸脂膜为支架，以人皮肤角质形成细胞为细胞来源，构建组织工程表皮模型，经检测HE染色、免疫荧光染色及透射电镜观察显示，构建的组织工程表皮模型分化良好，具有与正常表皮相似的结构：基底膜、棘层、颗粒层和角化层。组织工程表皮模型的IC50值为0.183%。在聚碳酸酯膜上构建的组织工程表皮模型具有与正常表皮相似的组织结构，并且具有一定的屏障功能。【专利说明】—种化妆品检测
本专利技术涉及能源化工领域，特别涉及一种化妆品检测。
技术介绍
化妆品已经成为现代人必不可少的日常用品，而化妆品对皮肤的刺激性是检测化妆品是否合格的重要标准。现在最常用的1944年John Draize建立的皮肤刺激性和腐蚀性实验，但是该实验存在一定的缺陷:兔的皮肤和人的皮肤在生理性能，对周围环境和化学物质的反应上不同，尽管从兔的皮肤实验获得的数据被作为刺激性评价的参考标准，但是由于很少的兔和人皮肤刺激实验结果被用来做对比研究，所以有些化学物质在兔和人的皮肤实验差距仍然比较大。兔皮肤刺激实验的重复性比较差。而且不再以动物模式为基础的毒理学系统已成为生物医学的重要发展方向，并被政府和国际法规所接受。一些动物实验替代方法已发展成为关系国际贸易的技术壁垒。 在专利CN 101297981 A中公开一种组织工程皮肤构建方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)配制组织工程皮肤培养液:以商用无血清表皮细胞培养液为基础液，再按每500mL基础液标准添加胰岛素20?50ng,氢化可的松100?300 μ g,维生素C20?40mg,氯化钙1?2mM ; (2)制备人体成纤维细胞饲养层:将人体来源的成纤维细胞经抑制增殖处理后，以常规细胞培养液添加体积比2?20%血清培养；(3)制备凝胶生物材料:将I型胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素按照8?12: 1?3: 1?2: 1?2质量份配比混合均匀，然后以1M氢氧化钠溶液调节PH至7.2?7.4 ; (4)构建和培养组织工程皮肤:将所述步骤(2)制备的1?10X 105个成纤维细胞与1?3mL所述步骤(3)制备的凝胶生物材料充分混合，得复合物，所述复合物在37°C，5% C02培养箱中培养2h，然后在上面添加1?10X105/mL人源表皮细胞悬液lmL，继续培养lh后，添加由所述步骤(1)配制的组织工程皮肤培养液3?5mL，继续培养至第5天，将所得的组织工程皮肤进行气液面培养，第20天结束培养，获得含有完好分化和成熟的表皮结构的组织工程皮肤。但是该专利技术的缺点在于应用胶原或脱细胞基质作为支架，这类支架内部有如海绵状的空隙或表面凹凸不平，在评价化学物质的刺激性时，容易附着化学物质不容易去除，胶原材料在接种细胞后容易收缩，所构建的组织工程表皮面积不容易保持在一定的规格，这些限制导致了应用此类组织工程表皮作检测使用时存在较大不可避免的误差。
技术实现思路
本专利技术应用组织工程方法，以聚碳酸脂膜为支架，以人皮肤角质形成细胞为细胞来源，构建组织工程表皮模型，经检测HE染色、免疫荧光染色及透射电镜观察显示，构建的组织工程表皮模型分化良好，具有与正常表皮相似的结构:基底膜、棘层、颗粒层和角化层。组织工程表皮模型的IC50值为0.183% (6.00 mmol/L)。在聚碳酸酯膜上构建的组织工程表皮模型具有与正常表皮相似的组织结构，并且具有一定的屏障功能。 本组织工程皮肤模型是在在聚碳酸酯膜上构建的表皮模型，优点有:聚碳酸酯膜有很好的生物相容性；采用面积一定的商品化的聚碳酸酯膜滤膜作为支架，该支架材料表面光滑，面积可以根据检测需要定制的特点，在其上构建的组织工程皮肤模型更容易商品化。本专利技术所构建的模型具有和正常皮肤相似的表皮分化结构，具有模拟化妆品作用于人表皮的功能，通过分析化妆品刺激作用后的组织工程表皮，可以比较准确判断化妆品的刺激性。 【具体实施方式】:1、主要试剂及仪器Epilife培养基、0.125%胰蛋白酶、Dispase II型分离酶、SDS、牛血清白蛋白、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、MTT、角蛋白10 (keratin 10，K10)和Κ13 (Κ10 & Κ13)抗体、Κ14抗体、层粘连蛋白(Laminin)抗体、FITC标记山羊抗兔IgG、FITC标记山羊抗鼠IgG、角化细胞交联外膜蛋白(Involucrin)抗体、中间丝相关蛋白(Filaggrin)抗体、Millicell细胞培养板。 C02培养箱、低温冰箱、倒置显微镜、突光显微镜、透射电镜、低温离心机。 2、脂质混合物配制将0.1 mol/L NaOH加热至70°C溶解软脂酸、亚油酸和花生四烯酸，将所得到的脂肪酸混合溶液与10%牛血清白蛋白混合，55°C恒温摇床10 min,使终浓度为软脂酸250 μ mol/L、亚油酸150 μ mol/L、花生四烯酸70 μ mol/L和牛血清白蛋白240 μ mol/L。 3、组织工程表皮模型构建取健康的人体包皮，进行角质形成细胞分离培养。Millicell细胞培养板的聚碳酸脂膜(孔径0.4 μ m，面积0.63cm2)经IV型胶原处理后，按细胞密度5 X 105个/cm2接种第1代角质形成细胞，置于37°C、5%C02培养箱以Epilife培养基培养，24 h后换液，48 h后改为气液面培养13 d。气液面培养时于Epilife培养基中添加脂质混合物，每100毫升培养基中添加10 mL脂质混合物，并添加CaCl2，使Ca2+浓度达1.5 mmol/L，添加抗坏血酸使浓度达50μ g/mL，培养13d后见表皮表面干燥、无培养基从膜底部渗透至表面，提示组织工程表皮模型制备成功。【权利要求】1.一种化妆品检测，其特征在于:本专利技术试剂主要包括Epilife培养基、0.125%胰蛋白酶、Dispase II型分离酶、SDS、牛血清白蛋白、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、MTT、角蛋白10 (keratin 10，K10)和 K13 (K10 & K13)抗体、K14 抗体、层粘连蛋白(Laminin)抗体、FITC标记山羊抗兔IgG、FITC标记山羊抗鼠IgG、角化细胞交联外膜蛋白(Involucrin)抗体、中间丝相关蛋白(Filaggrin)抗体、Millicell细胞培养板。2.根据权利要求1所述方法，一种化妆品检测，其特征在于:本专利技术仪器主要包括CO2培养箱、低温冰箱、倒置显微镜、突光显微镜、透射电镜、低温离心机。3.根据权利要求1所述方法，一种化妆品检测，其特征在于:制备过程包括脂质混合物配制和组织工程表皮模型构建。4.根据权利要求3所述的脂质混合物配制，化妆品检测，其特征在于:将0.1 mol/LNaOH加热至70°C溶解软脂酸、亚油酸和花生四烯酸，将所得到的脂肪酸混合溶液与10%牛血清白蛋白混合，55°C恒温摇床10 min，使终浓度为软脂酸250 μ mol/L、亚油酸150μπιΟ1/L、花生四烯酸70 μ mol/L和牛血清白蛋白240 μ mol/L。【文档编号】G01N33/68GK104459145SQ201310417393【公开日】2015年3月25日 申请日期:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种化妆品检测，其特征在于：本专利技术试剂主要包括Epilife 培养基、0.125%胰蛋白酶、DispaseⅡ型分离酶、SDS 、牛血清白蛋白、软脂酸、亚油酸、花生四烯酸、MTT、角蛋白10（keratin 10，K10）和 K13（K10 & K13）抗体、K14 抗体、层粘连蛋白（Laminin）抗体、FITC标记山羊抗兔IgG 、FITC标记山羊抗鼠IgG 、角化细胞交联外膜蛋白（Involucrin）抗体、中间丝相关蛋白（Filaggrin）抗体、Millicell细胞培养板。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王阿慧，
申请(专利权)人：王阿慧，
类型：发明
国别省市：上海;31
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