MicroRNA-429在制备抗肝癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及MicroRNA-429在制备抗肝癌药物中的应用。本发明专利技术首次揭示miR-429在维持肝癌干细胞特性中起到重要的作用。高表达miR-429能够增强EpCAM+的肝癌干细胞的增殖、自我更新以及肿瘤形成能力；抑制miR-429的表达能够引起相反的效应。因此，miR-429可作为肝癌治疗的新靶点，miR-429抑制剂可作为肝癌治疗药物，同时对肝癌复发及转移起到预防作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药领域，更具体地，本专利技术涉及一种以microRNA-429(miR-429)为靶点的抗肝癌药物的制备和应用。
技术介绍
肝癌是常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，我国每年死于肝癌的患者占全世界肝癌死亡人数的45%。目前，关于肝癌发生的机制仍不清楚，而近年来的“干细胞”理论在肿瘤的研究方面引起了众多学者的关注。肿瘤干细胞假说认为只有很小一部分细胞有无限的增殖能力和分化潜能，具有引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性的能力，这样的细胞叫肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)。它在肿瘤的发生、恶化、转移、复发中起重要作用。目前，研究学者先后在多种恶性肿瘤，如白血病、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、鼻咽癌等实体肿瘤中鉴定分离到肿瘤干细胞的存在[1-5]。国内外专家学者对肝癌干细胞表面标志物不断进行着探究，研究表明EpCAM是高致瘤性肿瘤细胞的一个标记[6-8]。譬如，Kimura等[9]发现肝癌EpCAM+亚群具有更强的克隆形成率。体内致瘤实验发现在超免疫缺陷NOD/SCID/γcnull(NOG)鼠中，最少100个EpCAM+细胞即能形成肿瘤，而EpCAM-细胞不能成瘤。miRNAs是一种内源性的、长约22nt的RNA，它通过靶向mRNA导致其降解或翻译抑制而在动、植物中起到重要的调节作用。miRNAs广泛存在于灵长类、啮齿类、鸟类、鱼类、蝇类、蠕虫类、植物、病毒中，从2002年有统计的200多种到2008年底的将近9000种，miRNAs的发现呈现爆发性增长，并且不断有新物种中的miRNAs被发现。人类miRNAs基因仅约占基因总数的2-3%，但却能调控人体内1/3的蛋白表达，这种转录后调控作用直接影响了这些靶基因的功能，参与了包括消化系统在内的多个系统的生理、病理过程。miRNAs在消化系统中的作用涉及发育、老化、分泌、代谢、病毒感染、免疫反应、肿瘤等等方面，尤其是作为癌基因或者抑癌基因在肿瘤发生发展中的作用显的尤为重要。以前的研究表明，miR-200microRNA家族成员，尤其是miR-429在多种肿瘤中高表达，并且对于保持上皮表型、诱导细胞基质上皮转化起重要作用[10-14]。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供肝癌治疗的新靶点。本专利技术的另一目的在于提供MicroRNA-429在制备抗肝癌药物中的应用。本专利技术的另一目的在于提供以miR-429为靶点的小分子核酸药物及其在肝癌治疗中的应用。在本专利技术的第一方面，提供一种用于治疗肝癌的小分子核酸药物。所述的药物是一类miR-429的抑制剂，通过抑制或阻止miR-429与其靶基因结合的物质，从而抑制EpCAM阳性的肝癌干细胞的增殖、自我更新及肿瘤形成能力，起到对肝癌的治疗、预防复发及转移等效果。所述的miR-429抑制剂包括(但不限于)：miR-429的反义核酸、miR-429的锁核酸反义核酸、siRNA；或携带或表达miR-429的反义核酸、miR-429的锁核酸反义核酸、siRNA的构建物(如表达载体)。所述的miR-429抑制剂是：包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的反义核苷酸，或其修饰形式包括(但不限于)：锁核酸修饰、甲氧基化修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替的修饰。本专利技术还提供一种miR-429的用途，用于作为筛选治疗肝癌的潜在物质的靶标；以及一种筛选治疗肝癌的潜在物质的方法；较佳地，所述的肝癌是肝细胞癌或EpCAM+的肝癌。所述筛选治疗肝癌的潜在物质的方法，包括：(1)用候选物质处理表达miR-429的体系；和(2)检测所述体系中miR-429的表达情况；其中，若所述候选物质可降低miR-429的表达，则表明该候选物质是治疗肝癌的潜在物质。再一个优选例中，所述筛选方法中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达miR-429的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中miR-429的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-429的体系；如果测试组中miR-429的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是治疗肝癌的潜在物质。在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对miR-429设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达miR-429的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于治疗肝癌有用的物质。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、miR-429促进EpCAM+细胞的比例。图2、过表达以及干扰miR-429表达对Spheroids形成的影响。图3、miR-429抑制剂对肿瘤生长的抑制作用。具体实施方式本专利技术人经过长期研究，首次揭示miR-429在维持肝癌干细胞特性中起到重要的作用。高表达miR-429能够增强EpCAM+的肝癌干细胞的增殖、自我更新以及肿瘤形成能力。相反的，在EpCAM+的肝癌干细胞中抑制miR-429的表达能够引起相反的效应。因此，miR-429可作为肝癌治疗的新靶点，抑制miR-429的小分子核酸药物可用于肝癌患者术后辅助治疗的有效手段，同时对肝癌复发及转移起到预防作用。miR-429及其用途本专利技术中，所述的miR-429是具有如下所示核酸序列的小核糖核酸(SEQID NO:1)：miR-429:5’-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3’；miR-429是为一种本领域已知的microRNA(miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。然而本领域之前对于miR-429与肝癌的干细胞特性之间的相关性没有研究。miR-429可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了miR-429或其前体的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-429或其前体。在本专利技术的具体实施例中，利用细胞生物学实验及模型动物体内实验等方法，发现以miR-429为靶点的小分子核酸药物在制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
miR‑429的抑制剂的用途，用于制备治疗肝癌的药物。

【技术特征摘要】
1.miR-429的抑制剂的用途，用于制备治疗肝癌的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于：抑制
EpCAM阳性的肝癌干细胞的增殖、自我更新及肿瘤形成能力。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-429抑制剂是抑制或阻止
miR-429与其靶基因结合的物质。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-429抑制剂包括：
miR-429的反义核酸、miR-429的锁核酸反义核酸、siRNA；或
携带或表达miR-429的反义核酸、miR-429的锁核酸反义核酸、siRNA的
构建物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-429抑制剂包括：
包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列的反义核苷酸，或其修饰形式。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝癌是肝细胞癌或
EpCAM阳性的肝癌。
7.一种miR-429抑制剂，其特征在于，其是：...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红阳，陈磊，李亮，杨文，唐境，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31