分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球制造技术

一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球的制备方法，包括如下步骤：首先在硅胶表面接枝双官能团戊二醛，然后在硅胶表面键合印迹分子，最后合成分子印迹聚合物微球。本发明专利技术的优点是：该分子印迹聚合物微球对于含有乙酰化K16的组蛋白H4水解后的标记肽段GGAKacR具有很好的识别能力及选择性，可以用于组蛋白H4水解样品中含有乙酰化K16的标记肽段的选择性富集及测定；同时由于印迹位点在材料表面，该分子印迹聚合物微球也能够对于C端具有GGAKacR序列的长链肽段进行选择性提取，在加标组蛋白水解样品的提取实验中，这种分子印迹微球对于肽段的回收率达到80％以上，可以在组蛋白H4-K16乙酰化的测定中发挥作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子印迹材料的制备，特别是一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球及其制备方法。
技术介绍
组蛋白是真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，在染色体组装方面起到了重要作用，目前已发现组蛋白具有多种翻译后修饰，这些翻译后修饰在调控基因动态表达方面有着重要的意义。组蛋白H4(Histone H4)是四种核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)之一，研究发现，组蛋白H4的N端第十六位的赖氨酸(简称为H4-K16)的乙酰化修饰对于染色体中的组装有着重要作用，这种修饰不但与染色质折叠缺陷相关，也影响细胞的周期调控。因此，对于组蛋白H4-K16乙酰化的分析具有重要的意义。由于蛋白翻译后修饰经常处于动态变化中，而且丰度较低，其分析鉴定比较困难，因此，应用具有选择性的富集材料进行提取分离十分必要，但另一方面，具有选择性的生物抗体存在价格昂贵、环境的耐受能力差的问题，因此，制备能够对于组蛋白H4-K16乙酰化的标记肽进行选择性富集的人工合成材料很有意义。分子印迹(molecular imprinting)是一种制备具有识别能力的聚合物的技术，非共价分子印迹是印迹技术常用的方法。在非共价分子印迹中，模板分子(也称印迹分子)与功能单体通过相互作用形成复合物，在交联剂存在下聚合形成印迹聚合物,在洗脱除去材料中的印迹分子后得到分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer,缩写为MIP)。MIP中具有尺寸及作用基团与印迹化合物相匹配的孔穴，这些孔穴形成了对于印迹分子的识别位点。由于MIP的识别能力类似于生物抗体，分子印迹技术也被称为制备人工抗体的技术。在蛋白等大分子印迹材料的合成中，为了减少传质阻力，限于表面的印迹方法(Surface-confined imprinting)被应用于分子印迹，其中一种方法是将印迹分子固载于介质表面，在印迹聚合后，除去固载介质，得到结合位点限于表面的印迹材料。这种印迹聚合物具有易于进入的结合位点，而且能够结合含有印迹分子链段且尺寸大于印迹分子的蛋白或多肽，在蛋白印迹中具有很强的优越性。选择蛋白分子中的能够和抗体结合的部分肽段作为印迹分子进行印迹，以合成的MIP用于整个蛋白的结合，称为抗原决定簇印迹法。本专利技术合成了一种对组蛋白H4-K16乙酰化(标记为H4-K16ac)具有识别能力的分子印迹聚合物微球，由于含有乙酰化K16的组蛋白H4水解后肽段(GGAKacR)可以作为H4-K16ac的标记物，合成中以GGAKacR为印迹模板分子，将其固载于硅胶表面；以三氟代甲基丙烯酸为功能单体，N’N-乙烯基双丙烯酰胺为交联剂，在印迹分子固载硅胶表面进行分子印迹合成；合成后除去GGAKacR固载硅胶，得到GGAKacR分子印迹微球(标记为GGAKacR-MIP)。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种多肽分子印迹微球及其制备方法，该分子印迹聚合物微球对组蛋白H4-K16乙酰化(标记为H4-K16ac)的标记肽段(GGAKacR)具有很好的识别能力及选择性，可以用于组蛋白H4水解样品中含有乙酰化K16的标记肽段的选择性富集及测定。本专利技术的技术方案：一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球，是以三氟代甲基丙烯酸为单体、N’N-乙烯基双丙烯酰胺为交联剂的交联高分子聚合物，粒径约为20微米，聚合物表面带有识别GGAKacR以及C端含有GGAKacR肽段的长链多肽的结合位点；微球材料对于GGAKacR有很好的选择性，作为吸附材料，分子印迹聚合物微球在磷酸盐缓冲液中对于GGAKacR的吸附容量为50μmol·g-1左右；微球材料对于印迹分子的印迹因子为2.5，印迹因子由IF＝QMIP/QNIP计算，其中QMIP是分子印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量(μmol·g-1)，QNIP为非印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量(μmol·g-1)；以分子印迹聚合物微球作为色谱固定相，以磷酸盐缓冲液(20mM，pH＝7.0)为流动相，印迹分子GGAKacR的保留因子为5.9左右，由液相色谱法测定的分子印迹材料的选择性因子α≥1.7，选择性因子由α＝kI/kX计算,其中，kI为印迹分子的保留因子，kX为其类似物的保留因子。一种所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球制备方法，包括如下步骤：1、硅胶表面接枝双官能团戊二醛；1)将硅胶微球与盐酸溶液混合，120℃下回流7h后过滤洗涤，先用蒸馏水洗至中性，再用丙酮清洗1次，最后于90℃真空干燥12h，得到活化后硅胶；2)将上述活化后硅胶与干燥甲苯混合，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在氮气保护下回流12h，反应完成后依次用甲苯、丙酮、蒸馏水、丙酮洗涤，最后于60℃下真空干燥12h，得到氨丙基键合硅胶(Sil-NH2)；3)将氨丙基键合硅胶(Sil-NH2)和戊二醛溶液加入磷酸盐缓冲溶液中并混合均匀，在30℃下反应6h，反应完成后抽滤，先用蒸馏水清洗至完全去除未反应的戊二醛，再用丙酮清洗1次，将得到微球于60℃下真空干燥12h，得到醛基键合硅胶(Sil-CHO)；2、在硅胶表面键合印迹分子1)将多肽(GGAKacRpbf)溶于新配制的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入醛基键合硅胶(Sil-CHO)，在振荡器中25℃下震荡24h，反应完成后用缓冲溶液和蒸馏水洗涤各清洗1次，真空干燥后，得到多肽固载硅胶；2)将上述多肽固载硅胶与三氟乙酸(TFA)溶液混合并于室温搅拌以脱去精氨酸的保护基团，经砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗至中性，最后无水乙醇清洗后于60℃下真空干燥备用，得到GGAKacR固载硅胶(Sil-GGAKacR)；3、分子印迹聚合物微球的合成1)将功能单体、交联剂和引发剂溶于磷酸盐缓冲液中，配置成预聚合溶液；2)将GGAKacR固载硅胶(Sil-GGAKacR)浸入预聚合溶液中,室温下静置3-4h，取出后用乙醇快速冲洗后转移至锥形容器中，通氮气除氧后密封，置于烘箱中在45℃下反应24h，将得到的微球转移到锥形容器中，加入10mL丙酮，再加入40wt％的HF溶液1.5mL，冰浴条件下放置1h后室温震荡12h，得到溶解硅胶后的印迹聚合物；3)将溶解硅胶后的印迹聚合物通过抽滤收集，依次用丙酮、蒸馏水清洗至中性后干燥，然后用乙腈-乙酸-水混合溶液进行索氏提取，再以甲醇索提，真空干燥后得到目标产物分子印迹聚合物微球(GGAKacR-MIP)。所述硅胶微球本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离组蛋白H4‑K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球，其特征在于：是以三氟代甲基丙烯酸为单体、N’N‑乙烯基双丙烯酰胺为交联剂的交联高分子聚合物，粒径为20微米，聚合物表面带有识别GGAKacR以及C端含有GGAKacR肽段的长链多肽的结合位点；微球材料对于GGAKacR有很好的选择性，作为吸附材料，分子印迹聚合物微球在磷酸盐缓冲液中对于GGAKacR的吸附容量为50μmol·g‑1左右；微球材料对于印迹分子的印迹因子≥2.5，印迹因子由IF＝QMIP/QNIP计算，其中QMIP是分子印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量(μmol·g‑1)，QNIP为非印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量(μmol·g‑1)；以分子印迹聚合物微球作为色谱固定相，以磷酸盐缓冲液(20mM，pH＝7.0)为流动相，印迹分子GGAKacR的保留因子为5.9，由液相色谱法测定的分子印迹材料的选择性因子α≥1.7，选择性因子由α＝kI/kX计算,其中，kI为印迹分子的保留因子，kX为其类似物的保留因子。

【技术特征摘要】
1.一种分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微球，其特征在于：
是以三氟代甲基丙烯酸为单体、N’N-乙烯基双丙烯酰胺为交联剂的交联高分子聚
合物，粒径为20微米，聚合物表面带有识别GGAKacR以及C端含有GGAKacR
肽段的长链多肽的结合位点；微球材料对于GGAKacR有很好的选择性，作为吸
附材料，分子印迹聚合物微球在磷酸盐缓冲液中对于GGAKacR的吸附容量为
50μmol·g-1左右；微球材料对于印迹分子的印迹因子≥2.5，印迹因子由IF＝QMIP/
QNIP计算，其中QMIP是分子印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量(μmol·g-1)，
QNIP为非印迹聚合物对于印迹分子的吸附容量(μmol·g-1)；以分子印迹聚合物微
球作为色谱固定相，以磷酸盐缓冲液(20mM，pH＝7.0)为流动相，印迹分子
GGAKacR的保留因子为5.9，由液相色谱法测定的分子印迹材料的选择性因子
α≥1.7，选择性因子由α＝kI/kX计算,其中，kI为印迹分子的保留因子，kX为其类
似物的保留因子。
2.一种如权利要求1所述分离组蛋白H4-K16乙酰化标记多肽的分子印迹微
球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1、硅胶表面接枝双官能团戊二醛；
1)将硅胶微球与盐酸溶液混合，120℃下回流7h后过滤洗涤，先用蒸馏水
洗至中性，再用丙酮清洗1次，最后于90℃真空干燥12h，得到活化后硅胶；
2)将上述活化后硅胶与干燥甲苯混合，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，
在氮气保护下回流12h，反应完成后依次用甲苯、丙酮、蒸馏水、丙酮洗涤，最
后于60℃下真空干燥12h，得到氨丙基键合硅胶(Sil-NH2)；
3)将氨丙基键合硅胶(Sil-NH2)和戊二醛溶液加入磷酸盐缓冲溶液中并混合
均匀，在30℃下反应6h，反应完成后抽滤，先用蒸馏水清洗至完全去除未反应
的戊二醛，再用丙酮清洗1次，将得到铁锈红色微球于60℃下真空干燥12h，
得到醛基键合硅胶(Sil-CHO)；
2、在硅胶表面键合印迹分子
1)将多肽(GGAKacRpbf)溶于新配制的磷酸盐缓冲溶液中，然后加入醛基键
合硅胶(Sil-CHO)，在振荡器中25℃下震荡24h，反应完成后用缓冲溶液和蒸馏
水洗涤各清洗1次，真空干燥后，得到多肽固载硅胶；
2)将上述多肽固载硅胶与三氟乙酸(TFA)溶液混合并于室温搅拌以脱去
精氨酸的保护基团，经砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗至中性，最后无水乙醇清
洗后于60℃下真空干燥备用，得到GGAKacR固载硅胶(Sil-GGAKacR)；
3、分子印迹聚合物微球的合成
1)将功能单体、交联剂和引发剂溶于磷酸盐缓冲液中，配置成预聚合溶液；
2)将GGAKacR固载硅胶(Sil-GGAKacR)浸入预聚合溶液中,室温下静置
3-4h，取出后用乙醇快速冲洗后转移至锥形容器中，通氮气除氧后密封，置于烘
箱中在45℃下反应24h，将得到的微球转移到...

【专利技术属性】
技术研发人员：董襄朝，杨芳芳，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12