本发明专利技术涉及一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒及其制备和应用，包括以下物质：（1）致敏原核表达肠道病毒71型VP1特异性抗原的羧化乳胶试剂；（2）致敏三株针对肠道病毒71型VP1的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂；（3）肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。本发明专利技术可以检测不同来源样本中的EV71抗原，克服了蛋白致敏普通乳胶时，致敏抗原量少、不稳定、致敏后的蛋白容易脱落等缺点。本发明专利技术的检测方法可用于肠道病毒71型的血清流行病学调查、临床辅助诊断以及EV71病毒的复制调控、抗病毒治疗药物筛选等科研领域。
【技术实现步骤摘要】
肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒制备及应用
本专利技术属于病原生物学检测
，具体涉及一种肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
手足口病是全球性传染病，近年来已经成为严重威胁儿童健康的传染病之一。其以发热和手、足、咽等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡，重症患儿病死率在10%-25%。 手足口病主要由肠道病毒属的柯萨奇病毒(Cox, A组16、4、5、7、9、10型，B组2、 5、13型)、埃可病毒(Echo)和EV71引起，其中以EV71及CoxA16型最常见。而EV71感染引起重症病例较为常见。我国自1981年在上海始见本病，之后多个省市区均有报道。2008年5月2日我国正式将手足口病列为丙类传染病进行法定传染病管理。 病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处，进一步繁殖并引起病变。易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症。患儿感染EV71后临床表现多样，从隐形感染、普通手足口病到中枢神经系统感染等重症，部分重症患者病情进展较快，甚至死亡。患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下儿童发病率高。与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病发生重症感染的比例相对较高。同时，由于肠道病毒传染性强，易引起暴发或流行。加强对EV71感染的防控，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。 目前对于EV71感染性疾病尚无特效的药物，主要采用对症及支持治疗，积极防止并发症发生。加强疾病及病原的监测、准确及时处置疫情、展开健康教育等是控制EV71流行的关键。EV71疫苗正在开发当中，将成为预防的关键。对人群特别是婴幼儿群体的EV71的血清流行病学状态和规律进行研究，可为手足口病的免疫规划的制订提供数据参考。因此EV71的抗体快速检测试剂盒的开发显得尤为必要。 而相关疫苗的开发及病毒抗原快速检测试剂盒的研制则是预防控制该病的关键。目前检测肠道病毒之方式除了传统的病毒培养鉴定法外，国内已有生物科技公司利用生物芯片技术研发出“肠道病毒鉴定芯片”(EV typing chip)，可快速检测出肠病毒之型别，不致延误病患就诊治疗的首要时机。因肠道病毒鉴定芯片感染易引起并发症，且往往在一星期内即转成重症，所以若能提早确知所感染的病毒类型，即可掌握对症治疗的第一时间。肠道病毒鉴定芯片鉴定芯片主要是针对并发症较严重之EV71、Cox A15、Cox A16及Cox B3等几型肠道病毒鉴定芯片所设计出的生物芯片，利用肠道病毒鉴定芯片的特定基因序列来鉴别肠道病毒鉴定芯片的类型。在我国公共卫生系统，出现手足口症状的患儿样本，咽拭子或肛拭子采样后，用探针标记的Real-time PCR进行肠道病毒检测。 目前已经研发出针对肠道病毒IgG、IgM抗体以及检测病毒病毒粒子的的ELISA试剂盒。中国医学科学院医学生物学研究所公开了 “EV71型病毒抗原的检测方法”专利(申请号200910094972.0)，该专利是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原。北京科兴生物制品有限公司公开了 “EV71病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法”专利(申请号200910131382.0)，该专利提供了一种采用具有光谱性活性的HD6单克隆抗体对EV71病毒抗原进行定量检测的方法。以上均是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原，适用于临床诊断，由于检测时间较长且需要借助专业仪器设备，价格昂贵，操作步骤繁琐费时，且需要洗板机，排枪，酶标记等昂贵仪器，不适合在普通的乡镇医疗机构推广使用。湖南康润药业有限公司公开了 “肠道病毒71型胶体金检测试纸条及其制备方法和应用”专利(申请号201210151666.8)，该专利是采用胶体金标记的方法来检测EV71抗体，方法简单快捷，但是成本高，不利于大规模的血清流行病学调查结果。
技术实现思路
针对现有技术的上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种用于检测肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒及其制备和应用，本专利技术基于羧化乳胶颗粒为载体，通过碳化二亚胺把目的蛋白或者抗体偶联到乳胶颗粒上，用于检测肠道病毒71型。 为达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒，由以下物质组成:(1)致敏原核表达肠道病毒71型VPl特异性抗原的羧化乳胶试剂；(2)致敏三株针对肠道病毒71型VPl的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂；(3)肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS和(4)含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。 一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤:(1)制备三种EV71单克隆抗体:用原核表达纯化的EV71VPl蛋白免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备若干株杂交瘤细胞，进行细胞培养后收集培养液，然后用免疫印迹方法筛选出三株特异性敏感性均较高的三株，进行层析纯化后浓缩并冻干，_80°C保存备用；(2)pET-28a-VPl的构建及蛋白表达纯化:把EV71-C4标准株的VPl基因克隆入原核表达载体pET-28a，BL21大肠杆菌中进行原核表达EV71病毒VPl蛋白，Ni柱进行亲和纯化，_80°C保存备用；(3)羧化乳胶凝集方法的建立:通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上，遵循固定其它条件，改换其中一个条件的原则，摸索偶联蛋白量，偶联时间，胶乳浓度，选择偶联反应终止剂和封闭剂；所述碳化二亚胺的工作液浓度为1.0-2.3%，碳化二亚胺的反应终浓度为60-80 μ 1，碳化二亚胺的反应时间为2.5-3小时；所述的偶联蛋白量为20-70ug，偶联时间为4.5-9.6小时，所述的乳胶浓度为110-180ul ；所述的偶联反应终止剂为20-60 μ I的0.1M乙醇胺溶液加入l-2mlpH8.0硼酸缓冲液悬浮的乳胶溶液中制得；(4)肠道病毒71型抗原抗体的快速双向乳胶凝集检测试剂盒的组装:将上述制备好的致敏乳胶、阴阳性对照、载玻片和胶棒组装成检测试剂盒。 所述步骤(3)中通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上的具体步骤为:Ca)取羧化胶乳放入离心管中，用pH9.6的碳酸缓冲液洗3遍后，再用pH4.5的磷酸缓冲液洗3遍；(b)加入水溶性碳化二亚胺在pH4.5的磷酸缓冲液中室温作用3h ；(c)用pH8.0硼酸缓冲液洗3遍；(d)在胶乳悬液中加入VPl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒，其特征在于由以下物质组成：（1）致敏原核表达肠道病毒71型VP1特异性抗原的羧化乳胶试剂；（2）致敏三株针对肠道病毒71型VP1的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂；（3）肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS和（4）含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。
【技术特征摘要】
1.一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒，其特征在于由以下物质组成: (1)致敏原核表达肠道病毒71型VPl特异性抗原的羧化乳胶试剂； (2)致敏三株针对肠道病毒71型VPl的单克隆混合抗体的羧化乳胶试剂； (3)肠道病毒71型阴阳性标准血清，灭活病毒溶液及PBS 和(4)含有可供致敏乳胶进行凝集反应的玻片平台及用于混匀乳胶和待反应血清的牙签或塑胶棒。2.一种肠道病毒71型乳胶凝集检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)制备三种EV71单克隆抗体:用原核表达纯化的EV71VPl蛋白免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备若干株杂交瘤细胞，进行细胞培养后收集培养液，然后用免疫印迹方法筛选出三株特异性敏感性均较高的三株，进行层析纯化后浓缩并冻干，_80°C保存备用； (2)pET-28a-VPl的构建及蛋白表达纯化:把EV71-C4标准株的VPl基因克隆入原核表达载体pET-28a，BL21大肠杆菌中进行原核表达EV71病毒VPl蛋白，Ni柱进行亲和纯化，_80°C保存备用； (3)羧化乳胶凝集方法的建立:通过碳化二亚胺把纯化后的蛋白或者单克隆抗体偶联到乳胶颗粒上，遵循固定其它条件，改换其中一个条件的原则，摸索偶联蛋白量，偶联时间，胶乳浓度，选择偶联反应终止剂和封闭剂； 所述碳化二亚胺的工作液浓度为1.0-2.3%，碳化二亚胺...
【专利技术属性】
技术研发人员：钦博，屠春雨，傅利军，何婷婷，
申请(专利权)人：绍兴市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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