本发明专利技术公开了一种屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养的方法，两者均为动物饲养中重要的益生菌，广泛应用于饲料添加剂中作为微生物制剂。屎肠球菌为乳酸菌的一种，在发酵过程中能产酸和细菌素等抑菌物质，枯草芽孢杆菌适合在中性条件下培养。经研究发现两者混合培养的不同接种比例、装料系数、培养基成分用量等对最后收获菌体时的生物量有重大影响，经过对培养基成分和培养条件的优化最终获得了能够显著提高二者混合培养总生物量的方法，本发明专利技术适合于微生态制剂的液体发酵生产，其优点是将两种不同生长生理特征的菌株进行混合培养，最终总生物量有了显著提高，并且二者生物量的比例接近1:1，提高设备利用率，降低生产成本。
【技术实现步骤摘要】
一种屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养提高生物量的方法
本专利技术涉及一种屎肠球菌和芽孢杆菌混合培养的方法，尤其涉及一种屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养提高生物量方法，属于生物
技术介绍
益生素（Probitics）又名益生菌、活菌剂、微生态制剂等，是活的微生物饲料添加剂。经口或其他粘膜途经投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制，提高饲料利用率、增强动物抗病能力和提高生产性能等作用。在饲料工业中人们将微生态制剂作为抗生素最有效的替代产品之一，寄希望于通过微生态制剂生产安全的畜禽产品，同时强化对环境的保护。2013年12月我国农业部2045号公告公布了《饲料添加剂品种目录（2013）》，其中针对养殖动物允许在其饲料中添加的微生物有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种。微生态制剂根据菌株的组成又可分为单一菌剂和复合菌剂，单一菌剂的研究和开发较多，目前的发展趋势是研制复合菌剂。复合菌剂能适应多种条件和宿主，比单一菌制剂更能促进畜禽的生长和提高饲料转化率。目前应用于畜禽养殖业微生态制剂中的益生菌主要是乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌。乳酸菌能发酵产生乳酸降低肠道pH，并且能够分泌细菌素从而抑制致病菌的生长。芽孢杆菌能够产生维生素、各种酶以及多种代谢产物，对饲料的降解消化吸收和动物的营养代谢起到促进作用。酵母菌菌体中含有非常丰富的蛋白质、B族维生素、脂肪、糖、酶等多种营养成分，在提高动物免疫力、生产性能和减少应激等方面均有作用。乳酸菌为兼性厌氧菌，芽孢杆菌为好氧菌，两者的生长特性及营养要求差异很大，并且乳酸菌在培养的过程中会产生具有抑菌或杀菌效果的有机酸、过氧化氧、双乙酰和细菌素，其中细菌素对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，影响枯草芽孢杆菌的生长，混合培养菌体生物量较低，因此传统的工业发酵中通常采用单独培养，然后再混合的生产工艺，由此造成设备利用率低，周期延长，生产成本增加，目前还没有屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养的报道。
技术实现思路
针对现有生产工艺的不足，本专利技术的目的在于提供一种屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养提高生物量的方法。本专利技术方法具体步骤如下：（1）将斜面保存的屎肠球菌菌株接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养14h，连续增殖三代；将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌株接种到LB液体培养基中活化，37℃、150rpm摇床培养14h，连续增殖三代。（2）将活化好的屎肠球菌和枯草芽孢杆菌按体积比1:12-1:8的比例混合后，按体积百分比3-6%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在35-42℃、装料系数（即发酵培养基与容器的体积比）为1/8-1/10、150-180rpm的条件下摇床培养16-20h获得，其中发酵培养基组成为蛋白胨13.0-16.0g/L，牛肉膏13.0-16.0g/L，酵母粉6.0-8.0g/L，葡萄糖18.0-22.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，pH6.2-6.8。上述屎肠球菌（Enterococcusfaecium）为肠球菌属菌株，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为芽孢杆菌属菌株。上述屎肠球菌和枯草芽孢杆菌的活化中所用的LB液体培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠（NaCl）10.0g/L。上述MRS液体培养基配方为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H20)2.0g，柠檬酸氢二胺[(NH4)2HC6H507]2.0g，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O)0.2g，硫酸锰(MnSO4·H20)0.04g，吐温﹣801.0mL，蒸馏水1000mL。本专利技术方法，适用于微生态制剂的液体发酵生产，本专利技术利用两种菌株的生理特点进行混合培养，最终总生物量有了显著提高，比单独培养时至少提高了5倍，并且二者生物量的比例接近1:1，芽孢率也比较理想，提高设备利用率，降低生产成本。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不局限于所述内容。实施例1：屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养提高生物量方法中不同接种比例的比较，具体操作如下：（1）将斜面保存的屎肠球菌菌株接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养14h，连续增殖三代；将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌株接种到LB液体培养基中，37℃、150rpm摇床培养14h，连续增殖三代。（2）将充分活化的屎肠球菌和枯草芽孢杆菌按照体积比1:12，按接种体积百分比3%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，37℃、装料系数为1/10（即每500ml的发酵瓶装50ml的发酵培养基）、180rpm摇床培养16h收获，对照组中二者比例为1:5，其余处理均相同。MRS液体培养基配方为蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H20)2.0g，柠檬酸氢二胺[(NH4)2HC6H507]2.0g，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O)0.2g，硫酸锰(MnSO4·H20)0.04g，吐温﹣801.0mL，蒸馏水1000mL，115℃条件灭菌30min。LB液体培养基配方为蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠（NaCl）10.0g/L，121℃条件灭菌20min。发酵培养基组成为蛋白胨14.0g，牛肉膏14.0g，酵母粉7.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H20)2.0g，柠檬酸氢二胺[(NH4)2HC6H507]2.0g，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g，硫酸锰(MnSO4·H20)0.04g，蒸馏水1000mL，pH6.5。采用平板稀释涂布法检测，得知试验组发酵液中屎肠球菌与枯草芽孢杆菌活菌数分别达到3.91×1010CFU/mL和2.92×1010CFU/mL，二者的生物量接近1:1。对照组屎肠球菌与枯草芽孢杆菌活菌数分别2.89×1010CFU/mL和1.41×1010CFU/mL，对照组生物量低于试验组，且两种菌体生物量的比例有所失衡。实施例2：屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养提高生物量方法中不同装液量的比较，具体操作如下：（1）将斜面保存的屎肠球菌菌株接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养14h，连续增殖三代；将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌株接种到LB液体培养基中，37℃、150rpm摇床培养14h，连续增殖三代。（2）将充分活化的屎肠球菌和枯草芽孢杆菌按照体积比1:12，按接种体积百分比3%的比例将混合菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养提高生物量的方法，其特征在于：将活化好的屎肠球菌和枯草芽孢杆菌按体积比1:12‑1:8的比例混合后，按体积百分比3‑6%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在35‑42℃、装料系数为1/8‑1/10 、150‑180rpm的条件下摇床培养16‑20h获得，其中发酵培养基组成为蛋白胨13.0‑16.0g/L，牛肉膏13.0‑16.0g/L，酵母粉6.0‑8.0g/L，葡萄糖18.0‑22.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，pH 6.2‑6.8。
【技术特征摘要】
1.一种屎肠球菌和枯草芽孢杆菌混合培养提高生物量的方法，其特征在于：将活化好的屎肠球菌（Enterococcusfaecium）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）按体积比1:12-1:8的比例混合后，按体积百分比3-6%的比例将混合菌种接种在发酵培养基中，在35-42℃、装料系数为1/8-1/10、150...
【专利技术属性】
技术研发人员：林连兵，胡治铭，郑健，梁丛丛，邓先余，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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