一种适用于菊花的流式细胞术样品的制备方法技术

本发明专利技术属于流式细胞术检测领域，提供一种适用于菊花的流式细胞术样品的制备方法。该方法包括：裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染色的细胞核；染色步骤：对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。本发明专利技术针对菊花流式细胞术分析采用了适当的细胞裂解缓冲液，能够有效地去除菊花完整的细胞核中残留的胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集；并保护DNA不被降解；并提供适合的环境用来进行专一的核DNA化学染色，有效地降低胞质成分对染色的负面影响；本发明专利技术中，样品制备流程的优化有效的减少了上机测试中杂峰的出现，提高了检测结果的精确性、准确性和稳定性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于流式细胞术检测领域，特别涉及一种适用于菊花的流式细胞术样品的制备方法，该方法通过针对菊花配制合适的细胞裂解缓冲液等反应液，得到合适的用于流式细胞术分析的菊花样品。
技术介绍
菊花(chrysanthemum morifolium)是菊科(compositae)菊属(chrysanthemum)植物，原产我国，是中国传统十大名花和世界四大切花之一，也是北京市的市花。我国是栽培菊花的起源中心和菊属种质资源的分布中心(李辛雷，2004)，野生资源和栽培品种十分丰富，其瓣型花型变异繁多。在一千六百多年的栽培和应用历史过程中形成了大量色彩丰富且姿态各异的品种，不仅可用于观赏，而且广泛用于食用、药用和茶用。确定一些具有重要研究价值和经济性状的菊花物种的基因组大小，无论对将来的菊花全基因组测序还是其起源进化研究以及杂交育种工作等方面均能提供有价值的参考。菊花细胞染色体倍性的了解对于品种的鉴定、杂交组合的选配、杂交后代材料的提前筛选、亲缘关系的鉴定等均具有十分重要的意义。流式细胞术从1980开始作为一项重要的技术应用到植物研究中，其主要用途在于用来估计核DNA含量，确定植物染色体倍性和细胞周期分析(Galbraith，2004；Shapiro，2004；Bennett and Leitch，2005)。流式细胞术与其他传统的方法相比具有快速、方便和精确的特点(Dolezˇel and Bartos，2005)。流式细胞术的普及主要得益于相对简单的样品准备方法，简要的方法主要包括三步：(1)将植物组织样品在适合的缓冲液中切碎，释放细胞核。(2)用荧光染料对细胞核进行染色，定量的与DNA结合，因此基因组越大，DNA染色也越多。(3)染色的细胞核上机检测。通过与已知基因组大小的植物物种比较荧光染色量的多少，得出被测样品的基因组大小。样品制备中最重要的环节是将植物组织在细胞核裂解液中均匀的粉碎(Galbraith et al.,1983)。细胞裂解缓冲液应该能够去除完整的细胞核中残留的胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集。细胞裂解缓冲液还应该保护DNA不被降解，并提供适合的环境用来进行专一的核DNA化学染色，尽可能降低胞质成分对染色的负面影响。Loureiro(2006a)等系统的比较了四种常用的不同化学组分的核游离缓冲液：Galbraith(Galbraith et al.,1983)LB01(Dolezˇel et al.,1989)Otto(Μlrich andΜlrich,1991；Dolezˇel and Go¨hde,1995)Tris,MgCl2(Pfosser et al.,1995)。由于植物组织在结构和化学组成上的多样性，很难有一种单一的缓冲液很好地适用于所有物种(Dolezˇel and Bartosˇ,2005)。许多实验室倾向于研发自己的细胞裂解缓冲液配方。菊花由于其品种变异丰富，分布广泛，形态各样，它的起源及遗传背景相比其它众多植物要复杂得多，导致有些品种的菊花在用常规细胞裂解缓冲液处理时不能得到理想的效果，因此需要针对菊花特殊的形态结构和生理特点改进细胞裂解缓冲液和染色液，最终制备得到的样品适用于流式细胞仪的分析。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种适用于菊花的流式细胞术样品的制备方法，可以得到合适的用于流式细胞术分析的菊花样品。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，包括以下步骤：裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染色的细胞核；染色步骤：对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。进一步地，所述菊花的种类为甘菊、异色菊、亚菊、毛华菊、朝鲜菊、日本雏菊、紊蒿、紫花野菊。进一步地，所述裂解步骤中，菊花组织样品为菊花未开花植株上部的新生幼嫩叶片。进一步地，所述裂解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：15mM的MOPS缓冲液，2mM的乙二胺四乙酸二钠，0.5mM的四盐酸精胺，80mM的氯化钾，20mM的氯化钠，0-1％(v/v)的聚乙二醇单辛基苯基醚，0-1％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量为10，000)，0-0.2％(v/v)的β-巯基乙醇；所述细胞裂解缓冲液的pH值为7.5。进一步地，所述裂解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：15mM的MOPS缓冲液，2mM的乙二胺四乙酸二钠，0.5mM的四盐酸精胺，80mM的氯化钾，20mM的氯化钠，0.1％(v/v)的聚乙二醇单辛基苯基醚，1％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮(平均分子量为10，000)，0.1％(v/v)的β-巯基乙醇；所述细胞裂解缓冲液的pH值为7.5。进一步地，所述裂解步骤的离心处理中，转速为900-3000rpm rpm，温度为4℃，时间为3-10分钟。进一步地，所述裂解步骤的离心处理中，转速为1300rpm rpm，温度为4℃，时间为10分钟。进一步地，根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，所述染色步骤的染色处理中，采用的染色液含有50μg/ml的Rnase A、50μg/ml的碘化丙啶。本专利技术相比现有技术具有以下有益效果：1、因为本专利技术针对菊花流式细胞术分析进行了细胞裂解缓冲液的配制，所以能够有效地去除菊花完整的细胞核中残留的胞质碎片，保持细胞核在悬浮液中的稳定并阻止凝集，保护DNA不被降解，并提供适合的环境用来进行专一的核DNA化学染色，有效地降低胞质成分对染色的负面影响。2、本专利技术中，样品制备流程的优化有效的减少了上机测试中杂峰的出现，提高了检测结果的精确性、准确性和稳定性。附图说明图1：实施例1中，荧光微球(Flow-CheckTM Fluorospheres)校准图。图2：实施例1中，甘菊(C.lavandμlifolium)叶部照片及流式细胞仪分析结果。图3：实施例1中，异色菊(C.dichrum)叶部照片及及流式细胞仪分析结果。图4：实施例1中，亚菊(C.glabriuscμlum)叶部照片及及流式细胞仪分析结果。图5：实施例1中，毛华菊(C.vestitum)叶部照片及及流式细胞仪分析结果。图6：实施例1中，朝鲜菊叶部照片及流式细胞仪分析结果。图7：实施例1中，日本雏菊叶部照片及流式细胞仪分析结果。图8：实施例1中，紊蒿本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待染色的细胞核；染色步骤：对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。

【技术特征摘要】
1.一种适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在于：该方法包括
以下步骤：
裂解步骤：将菊花组织样品进行裂解处理、过滤处理、离心处理，得到待
染色的细胞核；
染色步骤：对所述待染色的细胞核进行染色处理，得到染色的细胞核。
2.根据权利要求1所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在
于：所述菊花的种类为甘菊、异色菊、亚菊、毛华菊、朝鲜菊、日本雏菊、紊
蒿、紫花野菊。
3.根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特
征在于：所述菊花组织样品为菊花未开花植株上部的新生幼嫩叶片。
4.根据权利要求1或2所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特
征在于：所述裂解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：
15mM的MOPS缓冲液，2mM的乙二胺四乙酸二钠，0.5mM的四盐酸精胺，
80mM的氯化钾，20mM的氯化钠，0-1％(v/v)的聚乙二醇单辛基苯基醚，0-1％
(w/v)的平均分子量为10000的聚乙烯吡咯烷酮，0-0.2％(v/v)的β-巯基乙醇；
所述细胞裂解缓冲液的pH值为7.5。
5.根据权利要求4所述适用于菊花的流式细胞术样品制备方法，其特征在
于：所述裂解步骤的裂解处理中，采用的细胞裂解缓冲液包括如下组分：
15mM的MOPS缓冲液，2mM的乙二胺四乙酸二钠，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昌，陈东亮，黄丛林，程曦，梁宏霞，苏国辉，黄敦辉，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11