本发明专利技术涉及一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌KL1-Liu干粉活菌制剂的制备方法，适用于功能性益生乳酸菌发酵剂、食用或饲用微生态制剂的生产。本发明专利技术利用筛选自藏灵菇中的产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1-Liu CGMCC No.7029，经活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和冷冻干燥等工序制备活菌制剂。本发明专利技术使用油菜籽蛋白胨全部替代了改良MRS培养基中的氮源，降低了生产成本，并通过优化生产发酵条件和冻干保护剂配方，使KL1-Liu菌株的活菌数量可达1010CFU/g以上，存活率达到85％以上。本发明专利技术制备的活菌制剂，价格低廉，活菌含量高，为优质的具有降血清胆固醇作用的益生活菌制剂/发酵剂。
【技术实现步骤摘要】
-种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌干粉活菌制剂的生产技术
本专利技术涉及一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌化I-Liu干粉活菌制剂的生产技术， 适用于功能性益生乳酸菌发酵剂、食用或饲用微生态制剂、功能性食品、功能性发酵食品的 生产。
技术介绍
本专利技术涉及的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu是从藏灵茹中 分离筛选得到的一种产胆盐水解酶并具有降低血清胆固醇作用的乳酸菌。 藏灵茹（Tibetan Ke化，TK)又称开菲尔粒，19世纪被人类发现。开菲尔粒起源 于俄罗斯北高加索地区，当地牧民将牛乳或山羊乳注入羊皮口袋经自然发酵生产酸乳酒， 其残留物再补加牛乳或山羊乳继续发酵，经长期发酵后在皮口袋中形成不规则颗粒状物 体，即为开菲尔粒。此后人们便直接将开菲尔粒添加到牛乳中，使之发酵成具有爽快酸味和 起泡性的保健饮料，即为开菲尔。开菲尔具有多种保健功效。开菲尔中的活菌对志贺氏菌、 沙口氏菌等病原菌的生长有强烈抑制作用；其中的酵母菌对结核杆菌、大肠杆菌有较强抗 菌活性。故开菲尔对肠道疾病、肺结核有很好疗效。此外，开菲尔中的乳酸菌产生的代谢产 物，如胆盐水解酶、胞外多糖等能有效预防高血脂症和肿瘤的发生。 在藏灵茹的黏多糖基质中微生物菌相主要W乳酸菌、酵母菌及少量醋酸菌为基础 的小生态系。本专利技术所用副干酪乳杆菌化I-Liu是从藏灵茹中分离筛选得到的一种益生乳 酸菌，可在生长代谢过程中产生大量高活力的胆盐水解酶，经过体外牛津杯试验和动物实 验证明具有降低机体血清总胆固醇含量的功效。其降低胆固醇机理是缘于副干酪乳杆菌 KLl-Liu代谢产生的胆盐水解酶炬ile Salt Hy化olase，BSH)。B甜是肠道中的双歧杆菌 属、乳杆菌属、乳球菌属中的多种乳酸细菌在生长过程中产生的代谢产物。大量实验证明， 胆盐水解酶能在肝肠循环中将结合胆盐分解，产生氨基酸与溶解度较低的游离胆盐。后者 能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。 早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血 清胆固醇含量的功效。迄今为止，国内外学者对乳酸菌降胆固醇作用机理的研究尚存在不 同观点，主要集中于W下H点；（1)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；（2)乳酸菌的胆 盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作 用；（3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。 目前，国内申请各种活菌制剂制备方法的专利较多，如江苏省微生物研究所有限 责任公司唐宝英和朱晓慧申请的酪酸菌活菌制剂及其制备方法(CN101032527)是由酪酸 菌制备的人兽两用活菌制剂；上海信谊药业有限公司陈彬华和姚义强申请的双歧H联活 菌制剂及制备方法(CN98110623. 4)是由两歧双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌和粪链球菌冷冻干 燥活菌粉；上海环伟生物科技有限公司张琴和陈建吕申请的一种复合微生物活菌制剂及 其制备方法和应用狂L200810034746)是球菌、酵母菌和芽抱杆菌分别液体扩大培养，然后 按所需比例混合，经固态发酵、干燥、粉碎制得的一种复合微生物活菌制剂。但关于利用分 离筛选自藏灵茹中的产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌KLl-LiU制备活菌制剂，利用自动发酵 罐高密度发酵，W及利用油菜巧蛋白腺完全替代改良MRS培养基中氮源的方法尚未见国内 外相关文献报道和专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产胆盐水解酶副干酪乳杆菌化I-Liu干粉活菌制剂的 生产技术。 本专利技术是通过W下技术方案实现的： 所述方法中，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu分离筛选自 吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵茹（又称开菲尔粒），并已于2012年12月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中也，其保藏号为；CGMCC No. 7029(菌株 KLl-Liu),保藏地址；北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。在含有碳酸巧和纳 他霉素的MRS选择性培养基上，畐Ij干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl-Liu菌株 的菌落大小2?3mm，菌落有较高黏性，表面粗趟如雪花状，边缘不规则，无光泽，扁平，灰白 色，半透明；个体形态呈杆状，长短不等，短链状排列，G+无芽抱杆菌。 所述方法中，将脱脂乳试管保种的副干酪乳杆菌化I-Liu菌株W改良MRS培养基 于37C培养16h，如此活化2?3代后，冷藏备用。 所述方法中，改良MRS培养配方组成：将MRS培养基中的IOg蛋白腺W 5g乳酪蛋 白水解物和5g膜蛋白腺替代，其他成分不变，调节抑为6. 5。 所述方法中，采用单因素试验优化改良MRS培养基，优化的501油菜巧蛋白腺改良 MRS培养基配方组成；葡萄糖20g、501油菜巧蛋白腺25g、巧樣酸二馈2g、磯酸氨二钟2g、己 酸轴5g、走水合硫酸镇0. 58g、四水合硫酸猛0. 25g、吐温-80 1血、蒸觸水1 000血，调节抑 为7. 0 (灭菌后抑降至6. 5)。 所述方法中，在上述试验的基础上，将活化好的菌液W 3% (V/V，体积分数）的接 种量移种至501油菜巧蛋白腺改良MRS培养基中，于37C培养16h，得到扩大培养液。 所述方法中，在上述试验结果基础上，采用四因素H水平正交试验优化小试发酵 条件。将化501油菜巧蛋白腺改良MRS培养基加入到化全自动发酵罐中，利用发酵罐灭 菌系统于115°C灭菌20min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将副干酪乳 杆菌化I-Liu菌株的扩大培养液按4% (V/V，体积分数）的接种量移种至发酵罐中，利用发 酵罐自动控温系统维持发酵温度为34C，发酵过程中W流加10 % (W/V，质量体积比浓度） 的灭菌化2〇)3溶液控制发酵液抑6. 5,揽拌转速为90r/min，发酵16h，得到发酵液。 上述方法中，化发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为 BI0F6005GBN。 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用立式高速冷冻离也机将化发酵液于 4°C条件下,400化/min离也20min，弃上清液，收集得到菌泥。 所述方法中，立式高速冷冻离也机由湘仪离也机仪器有限公司提供，型号为 化-21M。 所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥平均加入2只盛有100血的冻 干保护剂（14.5%麦芽糊精巧.5%脱脂奶粉）的冻干瓶中，混合均匀后，得到浓缩活菌制 剂。 上述方法中，采用单因素多水平试验，确定副干酪乳杆菌化I-Liu的冻干保护剂 较优组合配方为（W/V，质量体积比浓度）：14.5%麦芽糊精巧.5%脱脂奶粉（伊利牌高蛋 白局巧脱脂奶粉）。 所述方法中，将浓缩活菌制剂于-3(TC低温冰箱中预冻1化至完全冻结状态，得到 预冻活菌制剂。 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用化LABC0NC0真空冷冻干燥机（美国） 将预冻活菌制剂于冻干温度-55C、真空度0. 13mBar的条件下，冻干4她至完全干燥状态， 得到冻干活菌制剂。 所述方法中，在上述试验结果基础上，利本文档来自技高网...
【技术保护点】
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1‑Liu CGMCC No.7029。
【技术特征摘要】
1. 副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu CGMCC No. 7029。2. -种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)KLl_Liu CGMCC No. 7029菌株小试生产干粉活菌制剂的方法，其特征在于：将副干酪乳杆菌KLl-Liu 以改良MRS培养基于37°C培养16h，如此活化2?3代；将活化好的菌液以3%的接种量 移种至501油菜籽蛋白胨改良MRS培养基中，于37°C培养16h，得到扩大培养液；501油菜 籽蛋白胨改良MRS培养基配方组成：葡萄糖20g、501油菜籽蛋白胨25g、柠檬酸二铵2g、磷 酸氢二钾2g、乙酸钠5g、七水合硫酸镁0. 58g、四水合硫酸锰0. 25g、吐温-80 lmL、蒸馏水 1000mL，调节pH为7. 0 ;将上述扩大培养液按4%的接种量移种至2L 501油菜籽蛋白胨改 良MRS发酵培养基中，利用5L自动发酵罐进行灭菌和高密度发酵，控制发酵温度34°C，发酵 液pH6. 5,搅拌转速90r/min，发酵时间16h，得到发酵液；将发酵液于4°C、4000r/min离心 20min，收集得到菌泥；在600mL灭菌冻干瓶中，按离心前发酵液1/10体积的量（200mL)，加 入14. 5%麦芽糊精+5. 5%脱脂奶粉的冻干保护剂与收集的菌泥，混合均匀后，得到浓缩发 酵剂；将每个冻干瓶装量为l〇〇mL的浓缩发酵剂于-30°C预冻13h至完全冻结状态，得到预 冻发酵剂；利用美国6L LABC0NC0真空冷冻干燥机将预冻发酵剂于-55°C、真空度0. 13mBar 的条...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧，张红星，熊利霞，谢远红，高秀芝，金君华，
申请(专利权)人：北京北农汇邦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。