本发明专利技术公开了一种miR-193实时荧光定量PCR检测方法，包括血清中总RNA的提取步骤、逆转录合成cDNA反应、荧光定量PCR扩增反应、荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳等步骤。本发明专利技术易操作、准确，所采用的实时荧光定量PCR检测方法，巧妙的运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏的检测miR-193。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种miR-193实时荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
microRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度为18～24个核苷酸的非编码单链RNA 分子，普遍存在于各种生物中。miRNA在各种生理和病理过程中起重要的作用，并参与生命过程中一系列的重要进程，包括细胞增殖、分化和凋亡、个体发育、机体代谢及免疫调节。这些miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或断裂靶mRNA而调节基因的表达。miRNA并不是在发育的特定时段表达，而是更倾向于在特定细胞类型中表达。miRNA的这种表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNA有可能作为参与调控基因表达的分子。近年来研究表明miRNA可作为一种新兴的肿瘤标志物。前期研究发现miR-193可能参与了血液系统疾病的发生和发展，但miR-193在多发性骨髓（MM）中的表达调控研究尚未见相关报道。因此，我们拟先建立一种miR-193的检测方法，以期进一步探讨其与MM的关系及可能的生物学作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种易操作、准确的miR-193实时荧光定量PCR检测方法。本专利技术的技术解决方案是：一种miR-193实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：包括下列步骤：（1）血清中总RNA的提取步骤：无菌吸取300 μl血清样本于2.0 ml的EP管中，向样本中加入300 μl 2×变性溶液，室温下混合均匀后冰上孵育5 min；再向混合液中加入600 μl酸化的酚-氯仿，涡旋震荡60 s，常温下20,000 g，离心10 min，直至界面被压缩；然后移取上层水相约500 μl于新的1.5 ml EP管中；同时向移取的水相液体中加入625 μl无水乙醇，混合均匀备用；接着将试剂盒提供的过滤柱和收集管依次组装完毕，并做好标记；将先前加入625 μl无水乙醇的水相液体混合液移取至过滤柱中，12,000 g，离心30 s，弃液，保留收集管；然后向复位的过滤柱中加入700 μl总RNA提取试剂盒的miRNA 洗涤液 1，12,000 g，离心15 s；向再复位的过滤柱中加入500 μl总RNA提取试剂盒的洗涤液2、3，12,000 g，离心15 s，弃液，保留收集管，空管12,000 g，离心1 min，然后弃掉收集管及管中所有液体，并将过滤柱安装至新的收集管中，接下来向过滤柱中加入30～100 μl预热的洗脱液， 12,000 g，离心30 s；收集管中的液体即是回收的总RNA，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取吸光度值A260/A280在1.8～2.1用于实验；（2）逆转录合成cDNA 反应体系：RNA 模板2 μg，逆转录酶 2 μl，双蒸水补足至11 μl，混匀离心，70℃放置10 min，冰育2 min，再加入以下试剂：逆转录缓冲液（5×）5 μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合液2 μl，40 U/μl 的RNA酶抑制剂0.5 μl，200 U/μl的逆转录酶0.5 μl，双蒸水补足至25 μl，混匀，42℃ 60 min，70℃ 10 min；合成的cDNA放-80℃冰箱保存备用；（3）荧光定量 PCR扩增反应：反应体系：MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）22.5 μl，正反向miRNA 茎环引物各5 μl，逆转录PCR产物2 μl ，不含RNA酶的H2O补足至50 μl；95℃预变性20 s，1个循环；95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃ 31 s，40个循环；每管设立三个复孔；（4）荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳：因miR-193和内参U6分子量小，所以PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，且随时观察，防止分子跑出胶外。对建立荧光定量PCR检测miR-193的方法进行特异性、重复性等方法学评价；结果计算：反应设立3个复孔，记录每个反应管中的荧光信号到达阈值时所经历的PCR循环次数Ct值；取一个样本，连续3天内分别对miR-193和U6进行批内和批间的重复性测定，每次重复5复管。根据侧得的Ct值计算标准差s、变异系数CV值。批内Ct值平均为26.3928，CV值为1.245%；批间Ct值平均值26.4573，CV值为3.218%。统计学方法 利用SPSS 15.0统计软件分析数据资料，计算均数 ）、标准差s和变异系数CV，检验水准α设为0.05，两组样本间作独立样本t检验分析，以P<0.05表示有统计学意义。本专利技术易操作、准确，所采用的实时荧光定量PCR检测方法，巧妙的运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏的检测miR-193。附图说明图1 MM中miR-193和U6的实时荧光定量PCR扩增曲线。图2 健康对照组中miR-193和U6的实时荧光定量PCR扩增曲线。图3 MM和健康对照组外周血中U6的实时荧光定量PCR熔解曲线。图4 MM和健康对照组外周血中miR-193的实时荧光定量PCR熔解曲线。图5 miR-193和U6扩增产物的凝胶电泳图。（图5中：N：健康对照组，M：MM患者，Mar：DNA marker；marker左边是miR-193，右边是U6）图6 批内重复性结果。具体实施方式miR-193实时荧光定量PCR检测方法，包括下列步骤：材料：南通大学附属医院收治的MM患者56例，男32例，女24例，平均年龄（60±11）岁，所有病例均符合MM诊断标准。35名健康献血者来自南通市中心血站，男20名，女15名，平均年龄（58±9）岁。留取待检者血清标本2 ml，用RNA提取试剂盒提取总RNA。miR-193和U6 小核RNA（U6 snRNA）逆转录引物、miRNA茎环引物 （上海睿安生物科技有限公司），总RNA提取试剂盒（美国Life公司），逆转录试剂盒、MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×，立陶宛Fermentas公司），DNA 分子标记（大连Takara生物工程公司）。（1）血清中总RNA的提取步骤无菌吸取300 μl血清样本于2.0 ml的EP管中，向样本中加入300 μl 2×变性溶液，室温下混合均匀后冰上孵育5 min。再向混合液中加入600 μl酸化的酚-氯仿，涡旋震荡60 s，常温下20,000 g，离心10 min，直至界面被压缩，必要时可重复次步骤。然后移取上层水相约500 μl于新的1.5 ml EP管中。同时向移取的水相液体中加入625 μl（约1.25体积）无水乙醇（提前室温放置），混合均匀备用。接着将试剂盒提供的过滤柱和收集管依次组装完毕，并做好标记。将先前加入625 μl无水乙醇的水相液体混合液移取至过滤柱中，12,000 g，离心30 s，弃液，保留收集管。然后向复位的过滤柱中加入700 μl miRN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR‑193实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：包括下列步骤：（1）血清中总RNA的提取步骤：无菌吸取300 μl血清样本于2.0 ml的EP管中，向样本中加入300 μl 2×变性溶液，室温下混合均匀后冰上孵育5 min；再向混合液中加入600 μl酸化的酚‑氯仿，涡旋震荡60 s，常温下20,000 g，离心10 min，直至界面被压缩；然后移取上层水相约500 μl于新的1.5 ml EP管中；同时向移取的水相液体中加入625 μl无水乙醇，混合均匀备用；接着将试剂盒提供的过滤柱和收集管依次组装完毕，并做好标记；将先前加入625 μl无水乙醇的水相液体混合液移取至过滤柱中，12,000 g，离心30 s，弃液，保留收集管；然后向复位的过滤柱中加入700 μl总RNA提取试剂盒的miRNA 洗涤液 1，12,000 g，离心15 s；向再复位的过滤柱中加入500 μl总RNA提取试剂盒的洗涤液2、3，12,000 g，离心15 s，弃液，保留收集管，空管12,000 g，离心1 min，然后弃掉收集管及管中所有液体，并将过滤柱安装至新的收集管中，接下来向过滤柱中加入30～100 μl预热的洗脱液， 12,000 g，离心30 s；收集管中的液体即是回收的总RNA，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取吸光度值A260/A280在1.8～2.1用于实验；（2）逆转录合成cDNA 反应体系：RNA 模板2 μg，逆转录酶 2 μl，双蒸水补足至11 μl，混匀离心，70℃放置10 min，冰育2 min，再加入以下试剂：逆转录缓冲液（5×）5 μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合液2 μl，40 U/μl 的RNA酶抑制剂0.5 μl，200 U/μl的逆转录酶0.5 μl，双蒸水补足至25 μl，混匀，42℃ 60 min，70℃ 10 min；合成的cDNA放‑80℃冰箱保存备用；（3）荧光定量 PCR扩增反应：反应体系：MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）22.5 μl，正反向miRNA 茎环引物各5 μl，逆转录PCR产物2 μl ，不含RNA酶的H2O补足至50 μl；95℃预变性20 s，1个循环；95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃ 31 s，40个循环；每管设立三个复孔；（4）荧光定量PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳：因miR‑193和内参U6分子量小，所以PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，且随时观察，防止分子跑出胶外。...
【技术特征摘要】
1.一种miR-193实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）血清中总RNA的提取步骤：
无菌吸取300 μl血清样本于2.0 ml的EP管中，向样本中加入300 μl 2×变性溶液，室温下混合均匀后冰上孵育5 min；再向混合液中加入600 μl酸化的酚-氯仿，涡旋震荡60 s，常温下20,000 g，离心10 min，直至界面被压缩；然后移取上层水相约500 μl于新的1.5 ml EP管中；同时向移取的水相液体中加入625 μl无水乙醇，混合均匀备用；接着将试剂盒提供的过滤柱和收集管依次组装完毕，并做好标记；将先前加入625 μl无水乙醇的水相液体混合液移取至过滤柱中，12,000 g，离心30 s，弃液，保留收集管；然后向复位的过滤柱中加入700 μl总RNA提取试剂盒的miRNA 洗涤液 1，12,000 g，离心15 s；向再复位的过滤柱中加入500 μl总RNA提取试剂盒的洗涤液2、3，12,000 g，离心15 s，弃液，保留收集管，空管12,000 g，离心1 min，然后弃掉收集管及管中所有液体，并将过滤柱安装至新的收集管中，接下来向过滤柱中加入30～100 μl预热的洗脱液， 12,000 g，离心30 s；收集管中的液体即是回收的总RNA，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取吸光度值A260/A280在1.8～2.1用于实验；
（2）逆转录合成cDNA 反应体系：
RNA 模板2 μg，逆转录酶 2 μl，双蒸水补足至11 μl，混匀离心，70℃放置10 min，冰育2 min，再加入以下试剂：逆转录缓冲液（5×）5 μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合液2 μl，40 U/μl 的RNA酶抑制剂0.5 μl，200 U/μl的逆转录酶0.5 μl...
【专利技术属性】
技术研发人员：鞠少卿，申娴娟，赵虬旻，施维，戚菁，吴信华，丛辉，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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