本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒。该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其中，捕获抗体与前体蛋白HKa特异性结合；检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合。采用本发明专利技术提供的试剂盒检测HKP09/HKP15-HKa组合式标志物具有良好的准确性和灵敏性。其最低检测限为1.7ng/mL，检测范围为6ng/mL～120ng/mL。实验表明，本发明专利技术的试剂盒能够显著区分6种肿瘤样本(胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌)和正常人样本。本发明专利技术的试剂盒检测灵敏度和特异性高，适用于临床多肿瘤相关组合式标志物的早期筛查。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒。该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其中，捕获抗体与前体蛋白HKa特异性结合；检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合。采用本专利技术提供的试剂盒检测HKP09/HKP15-HKa组合式标志物具有良好的准确性和灵敏性。其最低检测限为1.7ng/mL，检测范围为6ng/mL～120ng/mL。实验表明，本专利技术的试剂盒能够显著区分6种肿瘤样本(胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌)和正常人样本。本专利技术的试剂盒检测灵敏度和特异性高，适用于临床多肿瘤相关组合式标志物的早期筛查。CGMCC No. 93322014.07.02CGMCC No. 93312014.07.02【专利说明】一种检测多肿瘤相关"多肽-蛋白组合式标志物"的双抗体 夹心试剂盒
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测多肿瘤相关"多肽-蛋白组合式标 志物"的双抗体夹心试剂盒。
技术介绍
恶性肿瘤在全球的发病率和死亡率正越来越高，已经成为威胁人类生命健康的第 一杀手。随着大气污染、粉尘侵袭和雾霾等严重影响生活环境的因素存在，肺癌已经排在了 全球的恶性肿瘤之首；由于饮食不规律，也使得胃癌、食管癌和肠癌等消化系统肿瘤也上升 为主要的恶性肿瘤；同时，酒精摄入过量、脂肪堆积过多、以及人口流动所带来的病毒性肝 炎传染加快等因素，肝癌已成为了我国的代表性恶性肿瘤之一；此外，乳腺癌这类恶性肿瘤 的突发也严重影响着女性的生活质量。恶性肿瘤的积极防治和有效治疗，对于提高人类的 健康水平，有着重大的意义。 随着科技手段的迅猛发展，对肿瘤的治疗方法和手段日渐丰富，肿瘤切除和器官 移植仍然是肿瘤患者治疗的主要方法，但真正意义上的肿瘤根治，在临床应用上仍然难以 实现，因此肿瘤的早期发现和早期诊断，变得尤为重要。需要注意的是，早期的肿瘤发病隐 匿、无明显症状、病理活检或影像学检查难以定位出微型肿瘤病发区，导致了多数肿瘤患者 就诊时已失去手术治疗的机会。因此，开发出更灵敏的检查技术或更特异的生物标志物，已 经成为了当前的恶性肿瘤早期诊断研究热点和难点，一旦这类研究成果出现，将大大的促 进肺癌、消化道癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤实现早期诊断，并将带来巨大的社会价值和市 场价值。 对多种肿瘤同时进行生物标志物的表达水平检测，既可以提高肿瘤的防范，又可 以降低多种肿瘤标志物单独检测时所造成的高成本。多肿瘤检测的代表性研究主要是多肿 瘤标志物蛋白芯片和全自动化学发光检测。有报道称多肿瘤标志物蛋白芯片在健康体检中 的应用价值较明显，而对确诊的肿瘤患者，化学发光检测变得更加可靠。多种肿瘤标志物 芯片检测系统是将试剂点到一定的固相上，然后与待检的组织或细胞"结合"，再通过自动 化仪器检测其结果，具有高通量、高效率、研究全面、诊断更准确、方法简易等优势，但多数 研究目前仍停留在实验室阶段，相关产品的报道较少。 近年来，生物标志物联检在肿瘤的早期诊断中的应用研究得到很大重视。当机体 发生病变甚至是癌变时，干扰了正常的蛋白代谢，刺激了酶降解蛋白形成多肽的进程，也打 破了血清多肽和前体蛋白在机体的存在平衡。通过分析可以查找出哪些血清多肽或前体蛋 白与机体病变和病变程度相关，这些血清多肽或前体蛋白就成为了研究某些疾病的潜在标 志物。目前，被人们所认可的生物标志物多为血清蛋白标志物，也有少量解离的多肽标志 物，但对于蛋白标志物来说，普遍存在疾病敏感性不强的问题，而蛋白所解离的多肽标志物 分子量小、抗原表位少等缺陷，难以实现特异性高的双抗体夹心ELISA，使得多肽标志物研 究的存在着检测成本高、操作复杂的问题。因此，未完全解离的多肽-前体蛋白成为了肿瘤 标志物的理想选择。 高分子量激肤原（HighMolecularWeightKininogen?缩写为丽MK或HK)是血 浆中的一种糖蛋白，分子量120kDa，其分子可划分为6个结构域，其中Dl、D2和D3组成分 子的重链，D4含有缓激肽肽段，D5和D6区组成分子的轻链。HK被激肽释放酶活化，释放 D4区的缓激肽并产生双链高分子激肽原（HKa)。HKa的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。 HK转变为HKa后，发生较大的构像变化，使D5区暴露更加明显，D5是HKa的活性中心，发挥 ffla的主要作用，如介导炎症反应、抑制血管内皮细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制 肿瘤的生长与转移等。VillanuevaJ等人的研究报道称HKa蛋白所降解获得的相关肽段可 诊断乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤。 但是，目前对于新型的"多肽-蛋白组合式标志物"仍鲜有研究，因此，研制一种能 够用于多肿瘤检测的组合式标志物检测试剂盒是十分必要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种检测多肿瘤相关"多肽-蛋 白组合式标志物"的双抗体夹心试剂盒。本专利技术提供的试剂盒能够对血清中的"HKP09/ HKP15-HKa"实现灵敏和准确的检测。 蛋白HKa和多肽HKP09、多肽HKP15同属于激肽释放酶一激肽系统（Kallikrein- Kininsystem，KKS)代谢通路。本专利技术通过实验发现，多肽标志物HKP15和HKP09由HKa 代谢产生。具有SEQIDNO: 1所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D4区，具体位 于HKa蛋白的381?389位氨基酸，命名为HKP09。具有SEQIDN0:2所示氨基酸序列的 多肽标志物位于HKa蛋白的D5区，具体位于497?511位氨基酸，命名为HKP15。HKP09和 HKP15即为HKa降解，多肽HKP09和HKP15以未完全解离的形式存在于HKa表面。采用多肽 及其前体蛋白两种特异性抗体，对HKP15/HKP09-HKa标志物进行定量检测，或许可以更精 确的反映样品中标志物的表达情况，更加精确的区分胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝 癌样品与正常人样品。 本专利技术提供的"多肽-蛋白组合式标志物"的关键是前体蛋白结构中的特定多肽 与对应的游离型的特定多肽序列结构完全一致、免疫特性一致，多肽通过酰胺键或二硫键 等化学键形式存在于前体蛋白表面，是前体蛋白的一个重要结构域，多肽和蛋白互不干扰 各自的免疫学特异性结合位点。本专利技术提供的"多肽-蛋白组合式标志物"首次将激酶降 解的多肽HKP09及HKP15与其前体蛋白HKa进行优化组合，在检测时可同时分析紧密联系 的多肽和前体蛋白，而不能完全孤立的去分析蛋白或者多肽。突破"混合式"或单一标志物 的局限，最终实现该新型标志物与疾病之间的内在联系。所述组合式标志物不同于单一蛋 白标志物或单一多肽标志物，也不能理解为单一多肽和蛋白的简单混合。 本专利技术提供了一种检测胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌"多肽-蛋白组合 式标志物"的双抗体夹心试剂盒,包括捕获抗体和检测抗体； 捕获抗体与蛋白HKa特异性结合； 检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合； 多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示； 多肽HKP15本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌“多肽‑蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒，其特征在于，包括捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；所述检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合，所述多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述多肽HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述蛋白HKa的全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏开华，甄蓓，侯利平，孙云波，宋纯艳，杨保安，周婷婷，刘曙晨，郑俊杰，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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