一种热带醋杆菌全细胞催化生产甘油酸的方法技术

一种热带醋杆菌全细胞催化生产甘油酸的方法，涉及一种甘油酸的生产方法。1)一级摇瓶种子培养：将甘油酸生产菌热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701接种于装有一级种子培养基的摇瓶中培养；2)二级摇瓶种子：将步骤1)的一级摇瓶种子培养的种子接种于装有二级种子培养基的摇瓶中培养；3)菌体富集培养：将步骤2)的二级摇瓶种子培养的种子接种于装有菌体富集培养基的摇瓶中培养；4)菌体收集：取步骤3)培养所得菌液离心，洗涤，收集菌体，再加入甘油水溶液，调节初始pH为5～8；5)全细胞催化转化：将步骤4)所得的含有菌体的甘油水溶液于摇瓶中进行催化转化，得甘油酸。

【技术实现步骤摘要】
一种热带醋杆菌全细胞催化生产甘油酸的方法
本专利技术涉及一种甘油酸的生产方法，尤其是涉及一种热带醋杆菌全细胞催化生产甘油酸的方法。
技术介绍
甘油酸最初发现于一些植物中，如花生、朝鲜蓟叶子、番茄、香蕉、苹果、蚕豆、葡萄等，然而其中所含甘油酸的对映体组成及其浓度仍未知。动物中，如马、牛、猪、鼠、兔等动物的肝脏中也可检测出甘油酸，并主要以D-甘油酸的形式存在，是丝氨酸合成的前体(AkiraIchihara,DavidM.Greenberg.1957)。同时，人体中也检测出了D-甘油酸，是果糖分解的中间代谢产物。人体内存在的D-甘油酸具有促进乙醇和乙醛分解代谢的功能，该功能已在大鼠身上得到证实(Eriksson,etc.2007)。P·海诺在2003年发表的专利中阐述了D-甘油酸作为解酒药的作用机理：将D-甘油酸和酒精同时注入体内，可加速酒精排出体外。酒精在氧化的过程中会产生过量的NADH-乙醛脱氢酶和NADH-酒精脱氢酶复合物。在这两种NADH-复合物的催化作用下，D-甘油酸在酒精代谢组织细胞中会转化为D-甘油醛，再进一步转化为甘油。同时，NADH-复合物脱氢转化为NAD-乙醛脱氢酶和NAD-酒精脱氢酶复合物，新生成的NAD-复合物又恢复了氧化酒精的能力，从而加快酒精代谢。D-甘油酸促进乙醛进一步氧化为乙酸的同时，可能能够最大限度地减少乙醛的毒性作用(P.海诺.D-甘油酸或其盐用于制备增强酒精代谢的药物制剂的用途[P].中华人民共和国:200380101412.4,2009)。因此，若能大量生产D-甘油酸或其盐或酯类，用于制备增强酒精代谢的解酒药，不仅能提高了它的解酒疗效，也将带来更大的利润。同时，有研究表明，从朝鲜蓟叶子中提取出的甘油酸在狗体内具有胆固醇活性和肝兴奋剂功能。甘油酸衍生出的酯类低聚物能表现出抗胰蛋白酶活性(KLesová,etc.2001)，由于其生物可降解性优于乳酸低聚物，也可能运用于药物运输系统，如制备含有药物的微球粒(Wada,R.,S.-H.Hyon,andY.Ikada.1996)。目前，微生物生产甘油酸的报道甚少，主要采用醋酸杆菌作为生产菌株。近年来，只有日本Habe教授发表了有关微生物生产甘油酸的相关成果(HiroshiHabe,etc.2009)，国内目前尚无报道。同时，尽管通过传统发酵手段可以获得甘油酸，但是存在发酵产物复杂、副产物多，导致产物提取困难、提取成本高。所以在实际生产中，要想方设法在保证产量的情况下减少副产物，改善最终发酵液组成。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种热带醋杆菌全细胞催化生产甘油酸的方法。本专利技术包括以下步骤：1)一级摇瓶种子培养：将甘油酸生产菌热带醋杆菌(Acetobactertropicalis)CHM061701接种于装有一级种子培养基的摇瓶中培养；2)二级摇瓶种子：将步骤1)的一级摇瓶种子培养的种子接种于装有二级种子培养基的摇瓶中培养；3)菌体富集培养：将步骤2)的二级摇瓶种子培养的种子接种于装有菌体富集培养基的摇瓶中培养；4)菌体收集：取步骤3)培养所得菌液离心，洗涤，收集菌体，再加入甘油水溶液，调节初始pH为5～8；5)全细胞催化转化：将步骤4)所得的含有菌体的甘油水溶液于摇瓶中进行催化转化，得甘油酸。在步骤1)中，所述热带醋杆菌(Acetobactertropicalis)CHM061701，已于2014年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，该保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.9417；所述接种的接种量按质量百分比可为一级种子培养基的0.1％～1％；所述一级种子培养基的组成为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O0.5～2g/L，灭菌前pH6～7；所述培养的条件可于26～32℃，以150～250rpm培养16～28h。在步骤2)中，所述种子接种的接种量按质量百分比可为二级种子培养基的1％～10％；所述二级种子培养基的组成可为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O0.5～2g/L，灭菌前pH6～7；所述培养的条件可于26～32℃，以150～250rpm培养16～28h。在步骤3)中，所述种子接种的接种量按质量百分比可为菌体富集培养基的1％～10％；所述菌体富集培养基的组成可为甘油10～100g/L，酵母粉0.5～2g/L，蛋白胨0.5～2g/L，MgSO4·7H2O0.5～2g/L，KH2PO30.5～1.0g/L，K2HPO30.08～0.15g/L，灭菌前pH6～7；所述培养的条件可于26～32℃，以150～250rpm培养48～72h。在步骤4)中，所述菌液与甘油的质量比可为(0.1～0.2)∶(2.25～4.5)，所述甘油水溶液的质量浓度可为75～150g/L；所述离心的条件可于8000～12000rpm离心5～10min；所述洗涤可洗涤2～3次。在步骤5)中，所述催化转化的条件可在温度26～32℃下，以150～250rpm进行催化转化24～48h。所制得的甘油酸可采用HPLC测定转化结果，具体方法是：将所得甘油酸于8000～12000rpm离心5～10min收集上清液，通过HPLC测定转化结果。本专利技术采用热带醋杆菌(Acetobactertropicalis)CHM061701，全细胞催化生产甘油酸，经测试，转化24～48h，最终甘油酸产量可达10～15g/L，单位质量细胞产量2～3g/g，甘油酸转化率可达60％～70％，远高于传统方法的转化率20％～30％。另外，产物组成简单，甘油酸提纯容易，生产成本低，生产工艺简单。同时，采用本专利技术的生产方法，在保证产量的前提下，获得的最终发酵液中只有甘油和甘油酸无其他副产物，且催化转化过程无需无菌操作，极大的简化了提纯过程，从而降低生产成本，易于实现工业化应用。附图说明图1为甘油酸标准品的HPLC图。在图1中，横坐标为时间/min；出峰时间10.0min。图2为传统发酵液样品的HPLC图。在图2中，横坐标为时间/min；出峰时间10.0min，甘油酸产量10.73g/L。图3为全细胞催化过程中甘油酸和生物量变化曲线图。图4为全细胞催化样品HPLC图。在图4中，横坐标为时间/min；出峰时间10.0min，甘油酸产量12.75g/L。具体实施方式实施例11)一级摇瓶种子培养：将甘油酸生产菌AcetobactertropicalisCHM061701以1％的接种量接种于装有一级种子培养基的摇瓶中，于30℃，以200rpm培养24h。培养基组成为：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，pH6.5。2)二级摇瓶种子：将步骤1)的一级摇瓶种子以5％的接种量接种于装有二级种子培养基的摇瓶中，于30℃，以200rpm培养24h。培养基组成为：葡萄糖5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，pH6.5。3)发酵生产甘油酸：将步骤2)的二级摇瓶种子以5％的接种量接种于装有发酵培养基的摇瓶中，于30℃，以200rpm培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)CHM061701，已于2014年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.9417。

【技术特征摘要】
1.一种热带醋杆菌全细胞催化生产甘油酸的方法，其特征在于包括以下步骤：1)一级摇瓶种子培养：将甘油酸生产菌热带醋杆菌(Acetobactertropicalis)CHM061701接种于装有一级种子培养基的摇瓶中培养；所述热带醋杆菌(Acetobactertropicalis)CHM061701已于2014年7月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.9417；所述接种的接种量按质量百分比为一级种子培养基的0.1％～1％；所述一级种子培养基的组成为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O0.5～2g/L，灭菌前pH6～7；所述培养的条件于26～32℃，以150～250rpm培养16～28h；在步骤2)中，所述培养的条件于26～32℃，以150～250rpm培养16～28h；2)二级摇瓶种子：将步骤1)的一级摇瓶种子培养的种子接种于装有二级种子培养基的摇瓶中培养；所述种子接种的接种量按质量百分比为二级种子培养基的1％～10％；所述二级种子培养基的组成为葡萄糖1～10g/L，酵母粉2～10g/L，蛋白胨2～10g/L，MgSO4·7H2O0.5～2g/L，灭菌前pH6～7；3)菌体富集培养：将步骤2)的二级摇瓶...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢英华，蒲洋，陈慧敏，王宝贝，敬科举，陈翠雪，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35