本发明专利技术提供一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6月12日。该菌株的基因组同时具有操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因双重特性，并且，该菌株操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌应用于杆菌肽生产中，可使杆菌肽产量提高11.5%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。
技术介绍
杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。 目前，杆菌肽主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其通过微生物发酵法生产。 杆菌肽是通过硫模板机理缩合氨基酸而成的，而操纵子bacABC为编码杆菌肽合成过程中三个关键酶的基因。理论上来说，操纵子bacABC编码的肽合成酶的增多将有利于杆菌肽的合成，根据中心法则，即DNA的信息通过转录和翻译最终表现在蛋白质上，增加操纵子bacABC在菌体的拷贝数，从而提高bacABC的表达。但是，由于操纵子bacABC基因序列过长，约42kb，故无法构建含有如此大基因片段的质粒表达载体，也就无法以构建游离型或整合型质粒表达载体的方式来实现操纵子bacABC拷贝数的倍增，因此，操纵子bacABC的拷贝数增加变得极为困难。另外，recA基因为编码细菌DNA重组蛋白的基因，染色体上存在的同源序列在细菌DNA重组蛋白的作用下会进行交换重组，对菌株保持拷贝数的稳定性不利。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种能够高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌及其构建方法，此地衣芽孢杆菌的基因组同时具有操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的双重特性。 一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs （简称为：Bacillus licheniformis DW2△recA/ bacABCs），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。此菌株的基因组同时具有操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因双重特性，生产杆菌肽的能力强。一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤： （1）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒； （2）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和bacABC上、下游同源臂基因片段，同时，以载体pHY300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段；（3）将这5个基因片段融合，得到融合DNA片段，具体操作为：以bacABC上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过soe-PCR（即重叠延伸PCR）得到第一融合片段，同时，以bacABC下游同源臂和启动子为模板，通过soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正确排列顺序为：bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；（4）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamHI对融合DNA片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段；（5）将酶切后的融合片段与步骤（1）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到整合质粒T2（2）-ori-bacABCs，将整合质粒T2（2）-ori- bacABCs通过电转化转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过45℃和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经PCR验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，整合菌株的正确排列序列为：启动子—bacABC 开放阅读框（简称：bacABCORF）—bacABC终止子—bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；（6）采用四环素浓度梯度升高的培养基对整合菌株进行bacABC的诱导倍增，得到bacABC拷贝数扩增的整合菌株；（7）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；（8）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出recA同源臂，recA同源臂经过限制性DNA内切酶Spe I和Sac I双酶切，并将酶切后的recA同源臂与步骤（7）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到recA敲除质粒T2（2）-ori-recA；（9）将质粒T2（2）-ori- recA通过电转化转入步骤（6）得到的bacABC拷贝数扩增的整合菌株中，经卡那霉素筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经45℃和卡那霉素抗性双重筛选，PCR验证得到recA基因片段插入失活的菌株，即地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs。本专利技术的有益技术效果为： （1）本专利技术的整合质粒并不含有操纵子bacABC的开放阅读框，即并不能仅仅通过将整合质粒转入菌株内实现操纵子bacABC的倍增，但是，本专利技术的整合质粒中含有启动子基因片段，本专利技术通过将此含有启动子基因片段的整合质粒转入菌株内，以启动子基因片段为同源区域，利用菌株本身的同源重组交换功能，成功得到了bacABC阅读框倍增（即操纵子bacABC拷贝数倍增）的地衣芽孢杆菌菌株；（2）本专利技术的融合DNA片段中还含有四环素抗性基因片段，此四环素抗性基因片段同启动子一起整合进入菌株的基因组内，随着bacABC开放阅读框的倍增而倍增，这为bacABC拷贝数扩增的整合菌株的筛选提供了有利的条件；（3）本专利技术的采用质粒T2（2）-ori作为载体，由于质粒T2（2）-ori含有一个温敏型复制子，在37℃时质粒可正常复制，45℃质粒无法进行复制，故，它也为bacABC拷贝数扩增的整合菌株以及地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs的筛选提供了有利的条件；（4）在对淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段进行整合时，本申请人将这5个基因片段同时进行soePCR时，反复多次均得不到所需排列顺序的融合DNA片段，为了克服此问题，本申请人经过无数次试验，最终确定采用分段整合（即上游同源臂与淀粉酶终止子相连，下游同源臂与启动子相连，得到的两个片段再与四环素基因片段相连）的方式，最终成功得到了所需排列顺序的融合DNA片段；（5）在菌株基因组中的bacABCORF后仅插入bacABC上游同源臂—四环素基因——启动子—bacABC下游同源臂基因片段时，由于所获得的bacABC拷贝数扩增的整合菌株基因组中bacABCORF与下一个bacABCORF相距过于接近，会破坏bacABC终止子区，从而对菌株的操纵子bacABC造成结构上的影本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。
【技术特征摘要】
1.一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。
2.一种权利要求1所述的一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：
（1）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；
（2）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和bacABC上、下游同源臂基因片段，同时，以载体pHY300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段；
（3）将这5个基因片段融合，得到融合DNA片段，具体操作为：以bacABC上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过soe-PCR（即重叠延伸PCR）得到第一融合片段，同时，以bacABC下游同源臂和启动子为模板，通过soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正确排列顺序为：bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；
（4）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I对融合DNA片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段；
（5）将酶切后的融合片段与步骤（1）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到整合质粒T2（2）-ori-bacABCs，将整合质粒T2（2）-ori- bacABCs通过电转化转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过45℃和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经PCR验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，彭炳，王冬，李阳，祁高富，孔素芬，陈惠超，陈晓斌，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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