一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌DW2△recA/bacABCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6月12日。该菌株的基因组同时具有操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因双重特性，并且，该菌株操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌应用于杆菌肽生产中，可使杆菌肽产量提高11.5%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌工程菌株。 
技术介绍
杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽拥有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。  目前，杆菌肽主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其通过微生物发酵法生产。 杆菌肽是通过硫模板机理缩合氨基酸而成的，而操纵子bacABC为编码杆菌肽合成过程中三个关键酶的基因。理论上来说，操纵子bacABC编码的肽合成酶的增多将有利于杆菌肽的合成，根据中心法则，即DNA的信息通过转录和翻译最终表现在蛋白质上，增加操纵子bacABC在菌体的拷贝数，从而提高bacABC的表达。但是，由于操纵子bacABC基因序列过长，约42kb，故无法构建含有如此大基因片段的质粒表达载体，也就无法以构建游离型或整合型质粒表达载体的方式来实现操纵子bac本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。

【技术特征摘要】
1.一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△recA/ bacABCs，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014251，保藏日期为2014年6 月12日。
2.一种权利要求1所述的一种操纵子bacABC拷贝数倍增和敲除recA基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：
（1）质粒T2（2）-ori经过限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I双酶切得到线性的T2（2）-ori质粒，并回收线性T2（2）-ori质粒；  
（2）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增出淀粉酶终止子、启动子和bacABC上、下游同源臂基因片段，同时，以载体pHY300为模板扩增出四环素抗性基因片段，并回收淀粉酶终止子、启动子、四环素抗性和bacABC上、下游同源臂5个基因片段；
（3）将这5个基因片段融合，得到融合DNA片段，具体操作为：以bacABC上游同源臂和淀粉酶终止子为模板，通过soe-PCR（即重叠延伸PCR）得到第一融合片段，同时，以bacABC下游同源臂和启动子为模板，通过soe-PCR得到第二融合片段，再以第一融合片段、第二融合片段和四环素抗性基因片段为模板，通过soe-PCR得到融合DNA片段，融合DNA片段的正确排列顺序为：bacABC上游同源臂—淀粉酶终止子—四环素抗性基因—启动子—bacABC下游同源臂；
（4）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和BamH I对融合DNA片段进行双酶切，得到酶切后的融合片段；
（5）将酶切后的融合片段与步骤（1）得到的线性T2（2）-ori质粒连接，得到整合质粒T2（2）-ori-bacABCs，将整合质粒T2（2）-ori- bacABCs通过电转化转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到具有卡那霉素抗性的转化子，该转化子再经过45℃和卡那霉素抗性双重筛选，筛选到整合菌株，经PCR验证，得到具有正确排列序列的整合菌株，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，彭炳，王冬，李阳，祁高富，孔素芬，陈惠超，陈晓斌，
申请(专利权)人：绿康生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35