一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：无菌苗的获得：取成熟的山蜡梅果实，剥出带完整种皮的种子；愈伤组织的诱导和不定芽的诱导：将子叶切下，用解剖刀分成1cm2的小块，接种于基本培养基中；不定芽的增殖和壮苗：将分化出的芽从愈伤组织上切下,转入增殖培养基进行增殖培养；无根苗的生根：待不定芽生长3-4cm高时，切取健壮的不定芽，接种于生根培养基中；组培再生植株的炼苗和移栽：待生根的组培苗再生植株的苗高5cm、根数超过3根，根长超过5cm时，即可进行炼苗，3d后，捣碎培养基取出植株，将再生植株根部埋入培养土中。该方法培养山蜡梅生根快、玻璃化、褐化率低，成活率高。

【技术实现步骤摘要】
一种山錯梅组织培养与快速繁殖的方法
本专利技术属于植物培养
，具体涉及山腊梅的快速繁殖方法。
技术介绍
山錯梅Oliv.)，又名臭錯梅、秋錯梅、亮叶錯梅、野錯梅 等，为蜡梅科蜡梅属常绿灌木，产于安徽、浙江、江苏、江西、福建、湖北、湖南、广西、云南、贵 州和陕西等省区。叶入药，名山蜡梅，异名香风茶、毛山茶、岩马桑，其性温，味辛、微苦，具 祛风解表，芳香化湿之功效，主治流感、中暑、慢性支气管炎、湿困胸闷和蚊蚁叮咬等症。山 蜡梅叶具有浓郁的香味，其精油成分不仅具有镇痛、镇咳、祛痰作用，还能抑制食欲，明显减 缓小鼠的体重增长。临床上利用山蜡梅茶流感患者具显著疗效，尤其对由感冒引起的发烧 畏寒、眼结膜充血疗效最为显著。山蜡梅中因含有烯烃类化学成分，如石竹烯、大根香叶烯 等，可广泛用于香料、食品工业、药物合成中间体等；挥发性醇类化合物具有令人兴奋的、调 和性的玫瑰花香气味，而且具有抗腐败、抗滤过性病毒等特性，如芳樟醇、香叶醇和橙花叔 醇等，而雪松醇则具有柏木香气。山蜡梅叶挥发油中含大量桉叶油，广泛用于重要的香精香 料、食品添加齐U、化妆品、医药等。此外，山蜡梅解毒汤能治疗单纯疱疹性角膜炎，目前临床 上已开发出山蜡梅止咳露、山蜡梅滴丸等产品。此外，因为花期为9?12月，故山蜡梅也 是优美的常绿观赏灌木和具有观赏价值的秋季观花植物。山蜡梅的繁殖可以通过嫁接、压 条、扦插和种子等传统繁殖方法，但显然组织培养对于其快速繁殖、引种和优良性状的保持 具有不可忽视的作用。蜡梅属仅3种植物，且为我国特产。目前仅有蜡梅(C /TraecM)有 少量报道，外植体主要采用的是茎段或茎尖，极少数采用子叶和胚，走的是器官发生途径， 或先产生愈伤组织再分化，或出芽增殖；基本培养发基主要采用的是MS、改良MS和1/2MS， 诱导愈伤组织和分化采用的是6-BA+KT+2,4-D或6-BA+KT+NAA组合，茎段或茎尖的初代培 养主要采用的是6-BA+NAA或6-BA+IBA组合，增殖采用的是6-BA+NAA的组合，生根采用的 是IBA、NAA或两者的组合。但是总体而言，蜡梅组织培养存在着容易褐化、玻璃化和生根困 难等问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种生根快、玻璃 化、褐化率低，成活率高的山蜡梅快速繁殖方法 为实现本专利技术之目的，采用以下技术方案予以实现：一种山蜡梅组织培养与快速繁殖 的方法，依次包括以下步骤： (1)无菌苗的获得：取成熟的山蜡梅果实，剥出其长圆形的瘦果，用手术剪将瘦果两端 各剪去少许，剥出带完整种皮的种子，在超净工作台中将其浸泡于质量分数〇. 2%的HgCl2 溶液内消毒17-40 min，取出后无菌水浸泡冲洗3次，每次5 min;接种于添加了GA3 0.1 mg/ L +6-BA 2. 0 mg/L+NAA 0. 2mg/L的Nitsch基本培养基中。此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L，pH为5. 8-6.0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌20 min;在黑 暗中培养7 d后，转入光照培养，培养温度为25±1°C;每光照培养14 h后转入黑暗中培养 10 h，光照强度30-40 μ moV (m2*s);种子萌发后，待两片子叶展开并变绿时可取子叶作为 外植体，或待芽长出后取无菌苗的茎段作为外植体； (2) 愈伤组织的诱导和不定芽的诱导： 将子叶切下，用解剖刀分成I cm2左右大小的小块，接种于添加了 TDZ 0.1-2. 0 mg/ L+NAA 0-2.0 mg/L+PVP 0-5.0 mg/L+LH O-LO mg/L 的 Nitsch 基本培养基中，培养于光照 培养室内，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30-40 ymol/(m2*s); (3) 不定芽的增殖和壮苗： 将分化出的芽从愈伤组织上切下，转入增殖培养基Nitsch+TDZ 0-2. 0 mg/L+6-BA 0-5. 0 mg/L+CH 0-5. 0 mg/L+ PVP I. 0 mg/L 进行增殖培养； (4) 无根苗的生根： 待不定芽生长3-4 cm高时，切取健壮的不定芽，接种于生根培养基 12. 5-100%Nitsch+IAA 0-1. 0 mg/L +ΝΑΑ0-0. 5 mg/L+AC 0-2. 0 mg/L+ CH 2. 0 mg/L 中； (5) 组培再生植株的炼苗和移栽： 待生根的组培苗再生植株的苗高5 cm、根数超过3根，根长超过5 cm时，即可进行炼 苗，炼苗在光照培养室内进行；首先将组培瓶的瓶盖旋开，让内外空气交流，往瓶中添加少 量清水，12 h后可使瓶盖盖住半个瓶口，一半的空间接受日光灯的照射，再过12 h后，取下 组培瓶盖，让日光灯完全照射再生植株，3 d后，用玻璃棒将培养基捣碎，小心将再生植株取 出，于清水中仔细漂洗剩余的琼脂，将洗净琼脂的再生植株根部埋入培养土中，于植株上面 罩上透明容器，待再生植株定植抽出新的叶片后，即可取下容器。 作为优选方案：在所述步骤（2)中的Nitsch基本培养添加了 TDZ 0· 5 mg/L+NAA 0. 2 mg/L+PVP I. 0 mg/L+LH 0. 5 mg/L〇 作为优选方案：在所述步骤（3)中的增殖培养基为Nitsch+TDZ 0· 3 mg/L +6-BA 1. 0 mg/L+CH 2· 0 mg/L+ PVP I. 0 mg/L。 作为优选方案：在所述步骤（4)中的生根培养基为50% Nitsch+IAA 0· 5 mg/L + NAA 0· I mg/L+AC 0· 2 mg/L+ CH 2· 0 mg/L。 作为优选方案：在所述步骤（2)为丛生芽的诱导：待无菌苗的芽长到4 cm时，切下 接种于Nitsch+TDZ 0-2.0 mg/L +6-BA 0-5.0 mg/L+ PVP 0-5.0 mg/L+LH 0 -1.0 mg/L 的 培养基中，培养于光照培养室内，培养温度为25±1°C，每光照培养14 h后转入黑暗中培养 10 h，光照强度 30-40 μ mol/(m*s)。 作为优选方案：在所述步骤（2)的培养基为Nitsch+ TDZ 0· 6 mg/L +6-BA 2. 0 mg/L+PVP I. 0 mg/L+LH 0· 5 mg/L。 与现有技术相比较，本专利技术的有益效果是：通过本专利技术的方法培养山蜡梅，能够使 山蜡梅生根快、玻璃化、褐化率低，成活率高。 【具体实施方式】 实施例1 ，依次包括以下步骤： (1)无菌苗的获得： 取成熟的山蜡梅果实，剥出其长圆形的瘦果，用手术剪瘦果两端各剪去少许，注意不要 剪破种皮或伤害种子，用手指甲小心地剥出带完整种皮的种子，在超净工作台中将其浸泡 于0.2% HgCl2溶液内消毒17-40 min (过短时间容易污染，过长容易导致种子死亡)，取出 后无菌水浸泡冲洗3次，每次5 min,接种于Nitsch+GA30.1 mg/L +6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L ( + 意为混合）的培养基中。此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤：（1）无菌苗的获得：取成熟的山蜡梅果实，剥出其长圆形的瘦果，用手术剪将瘦果两端各剪去少许，剥出带完整种皮的种子，在超净工作台中将其浸泡于质量分数0.2% 的HgCl2溶液内消毒17‑40 min，取出后无菌水浸泡冲洗3次，每次5 min；接种于添加了GA3 0.1 mg/L +6‑BA 2.0 mg/L+NAA 0.2mg/L的Nitsch基本培养基中；此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8‑6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；在黑暗中培养7 d后，转入光照培养，培养温度为25±1℃；每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30‑40 μmol/(m2•s)；种子萌发后，待两片子叶展开并变绿时可取子叶作为外植体，或待芽长出后取无菌苗的茎段作为外植体；（2）愈伤组织的诱导和不定芽的诱导：将子叶切下，用解剖刀分成1 cm2左右大小的小块，接种于添加了TDZ 0.1‑2.0 mg/L+NAA 0‑2.0 mg/L+PVP 0‑5.0 mg/L+LH 0‑1.0 mg/L的Nitsch基本培养基中，培养于光照培养室内，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30‑40 μmol/(m2•s)； （3）不定芽的增殖和壮苗：将分化出的芽从愈伤组织上切下, 转入增殖培养基Nitsch+TDZ 0‑2.0 mg/L+6‑BA 0‑5.0 mg/L+CH 0‑5.0 mg/L+ PVP 1.0 mg/L进行增殖培养；（4）无根苗的生根：待不定芽生长3‑4 cm高时，切取健壮的不定芽，接种于生根培养基12.5‑100%Nitsch+IAA 0‑1.0 mg/L +NAA0‑0.5 mg/L+AC 0‑2.0 mg/L+ CH 2.0 mg/L中；（5）组培再生植株的炼苗和移栽：待生根的组培苗再生植株的苗高5 cm、根数超过3根，根长超过5 cm时，即可进行炼苗，炼苗在光照培养室内进行；首先将组培瓶的瓶盖旋开，让内外空气交流，往瓶中添加少量清水，12 h后可使瓶盖盖住半个瓶口，一半的空间接受日光灯的照射，再过12 h后，取下组培瓶盖，让日光灯完全照射再生植株，3 d后，用玻璃棒将培养基捣碎，小心将再生植株取出，于清水中仔细漂洗剩余的琼脂，将洗净琼脂的再生植株根部埋入培养土中，于植株上面罩上透明容器，待再生植株定植抽出新的叶片后，即可取下容器。...

【技术特征摘要】
1. 一种山蜡梅组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤： (1) 无菌苗的获得：取成熟的山蜡梅果实，剥出其长圆形的瘦果，用手术剪将瘦果两端 各剪去少许，剥出带完整种皮的种子，在超净工作台中将其浸泡于质量分数〇. 2%的HgCl2 溶液内消毒17-40 min，取出后无菌水浸泡冲洗3次，每次5 min;接种于添加了GA3 0.1 mg/ L +6-BA 2. 0 mg/L+NAA 0. 2mg/L的Nitsch基本培养基中；此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L，pH为5. 8-6.0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌20 min;在黑 暗中培养7 d后，转入光照培养，培养温度为25±1°C;每光照培养14 h后转入黑暗中培养 10 h，光照强度30-40 μ moV(m2*s);种子萌发后，待两片子叶展开并变绿时可取子叶作为 外植体，或待芽长出后取无菌苗的茎段作为外植体； (2) 愈伤组织的诱导和不定芽的诱导： 将子叶切下，用解剖刀分成1 cm2左右大小的小块，接种于添加了 TDZ 0.1-2. 0 mg/ L+NAA 0-2.0 mg/L+PVP 0-5.0 mg/L+LH 0-L0 mg/L 的 Nitsch 基本培养基中，培养于光照 培养室内，每光照培养14 h后转入黑暗中培养10 h，光照强度30-40 μ mol/(m2*s); (3) 不定芽的增殖和壮苗： 将分化出的芽从愈伤组织上切下，转入增殖培养基Nitsch+TDZ 0-2. 0 mg/L+6-BA 0-5. 0 mg/L+CH 0-5. 0 mg/L+ PVP 1. 0 mg/L 进行增殖培养； (4) 无根苗的生根： 待不定芽生长3-4 cm高时，切取健壮的不定芽，接种于生根培养基 12. 5-100%Nitsch+IAA 0-1. 0 mg/L +ΝΑΑ0-0. 5 mg/L+AC 0-2. 0 mg/L+ CH 2. 0 mg/L 中； (5) 组培再生植株的炼苗和移栽： 待生根的组培苗再生植株的苗高5 cm、根数超过3根，根长超过...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱诚，孙骏威，王飞娟，江琼，丁艳菲，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33