一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞检测方法，包含以下步骤：(1)分别制备目标稀有细胞悬浮液的标准样本和待测样本；(2)分别加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪分别对标准样本和待检样本进行弛豫时间测定；(3)使核磁共振造影剂与样本中的稀有细胞进行免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪分别对标准样本和待检样本进行弛豫时间测定；(4)计算弛豫时间改变量，绘制标准曲线，得出待检样本中目标稀有细胞的含量。本发明专利技术可简便、快速、高特异性和高灵敏度地检测生物体液样本中的稀有细胞，且由于两次检测之间没有样品的转移过程可获得较高准确率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方法
本专利技术涉及分子生物学检测技术，特别涉及一种生物体液样本中稀有细胞的检测方法。
技术介绍
稀有细胞是指生物体液样本(包括血液、胸水、腹水、尿液、脑脊液等)中的一些非典型细胞，大量研究表明，对稀有细胞的检测和鉴定对于相关疾病的病理机制及靶向药物开发具有重要指导意义。因此，寻找准确、快速地的稀有细胞检测方法将成为亟待解决的问题。然而稀有细胞在生物体液中的浓度非常低，与非目标细胞的比例大约是1：107，用传统技术无法计数，所以迫切需要一种简单准确快速的方法解决这一难题。由于循环稀有细胞在体液中的含量很少，要经过有效的富集步骤才能在后续的实验中识别鉴定。目前市场上广泛应用于稀有细胞检测研究的方法主要有密度梯度离心法、膜过滤法和免疫磁性分离技术。密度梯度区带离心法又称为区带离心法，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。使用此法可以同时使样品中几个活全部组分分离，具有良好的分辨率。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液。研究中经常利用密度梯度离心的原理，用ficoll液分离和纯化人或动物外周血单个核细胞(PBMC)。膜过滤方法是根据某些稀有细胞体积大于外周血中粒细胞从而使稀有细胞从外周血中分离富集出来，然后利用免疫荧光技术对稀有细胞进行鉴别诊断。该方法中，膜过滤细胞富集过程相对容易，但是并不是所有稀有细胞体积都大于外周血中粒细胞的，很多稀有细胞的体积和粒细胞大小差不多，甚至比粒细胞体积更小。基于以上的认识，膜过滤方法被逐渐抛弃。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可简便、快速、高特异性和高灵敏度地检测生物体液样本中含量较低的稀有细胞的低场核磁共振检测分析方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞检测方法，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞的细胞系，以缓冲液进行不同梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得稀有细胞悬浮液待检样本；(2)亲和富集前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T1；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T1’；(3)亲和富集后核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在4～8℃温度下孵育10～15min，使核磁共振造影剂与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T2；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4～8℃温度下孵育10～15min，使核磁共振造影剂与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T2’；(4)标准曲线制作与结果得出计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2-T1，以ΔT2为纵坐标，以标准样本中的目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线；计算待检样本的弛豫时间改变量ΔT2test，所述ΔT2test＝T2’-T1’，ΔT2test不为0，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲线得出待检样本中目标稀有细胞的含量。由上述检测步骤可知：本专利技术利用核磁共振造影剂可以和稀有细胞结合的特性，运用免疫磁性分离技术，在外加低磁场的作用下通过检验磁珠-细胞悬浮液中水分子的氢原子信号来定量循环稀有细胞。具体来说，本专利技术在利用密度梯度离心等方法前期处理细胞样品后，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂(即NMR检测反应体系)，采用适宜温度孵育诱导目标稀有细胞和免疫磁性微珠结合。通过NMR检测孵育前后两次弛豫时间变化来定量地反应体系中目标稀有细胞的数目信息。由于整个检测反应没有任何样品、试剂的加入和转移，使得体系处于一个稳定状态，排除了两次检测中由于外来物引入导致的假阳性，使得检测更加准确精密。本专利技术中所述的目标稀有细胞的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间特性参数的变化，所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间T。优选地，本专利技术的检测方法中，步骤(2)中所使用的核磁共振造影剂为顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠，且所述的顺磁性纳米磁珠或超顺磁性纳米磁珠优选为抗EpCAM免疫纳米磁珠、抗CD45免疫纳米磁珠、链霉亲和素纳米磁珠、叶酸修饰的磁性脂质体中的一种或几种。由于磁性微珠很小只有50nm(目前市面上商业化的同类磁珠多为μm级)，对细胞的功能和活性都不会产生影响，完全满足于稀有细胞检测需求(活细胞且细胞不会受损)。上述的免疫磁珠将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，从而快速地实现从混合细胞群中捕获和分离稀有目标细胞的目的，所得稀有细胞可用于计数或其他方面研究应用。优选地，本专利技术的检测方法中，所述步骤(2)中，在加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂之前，还包括下述步骤：加入偶联有抗CD45的核磁共振造影剂将非目标细胞进行磁性标记，通过外加磁场方式将上述标记的非目标细胞除去。本专利技术中免疫磁珠富集方法，除上述
技术实现思路
中步骤(2)所描述的直接加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，使核磁共振造影剂与稀有细胞发生靶向免疫(抗原抗体反应)富集(阳性富集)外，亦可采用阴性+阳性双富集的方法达到目标细胞磁性富集的目的。具体操作方法即为：在加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂之前，先利用偶联有抗CD45的核磁共振造影剂(磁性微珠)将非目标细胞(主要为上皮细胞中含量较多的白细胞等)进行磁性标记，通过外加磁场方式将白细胞从含有目标稀有细胞的细胞群混合物中去除掉(阴性标记非目标细胞)；然后，上述获得细胞亚群混合物，根据亚群标志物选择适宜的偶联有目标细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂(磁性微珠)进行免疫反应富集，从而获得标记有目标细胞的核磁共振造影剂(阳性标记目标细胞)。通过上述阴性+阳性双富集的操作方法，可达到排出干扰因素、更精确可靠地实现目标细胞磁性富集的目的。优选地，本专利技术的检测方法中，所述步骤(2)中，核磁共振造影剂加入量优选为：每200个目标稀有细胞中加入1微升核磁共振造影剂。此比例的核磁共振造影剂不但可以最优化地获得稀有细胞，还能够减少由于核磁共振造影剂加入过多导致的背景增强，影响检测效果。优选地，本专利技术的检测方法中，所述步骤(2)和步骤(3)中，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度为20～25MHz，磁体温度为30～35℃，重复时间3～5s。更优选地，控制低场核磁共振分析仪的磁场强度优选为20.18MHz，磁体温度优选为35℃，重复时间优选为5s本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞的细胞系，以缓冲液进行不同梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得稀有细胞悬浮液待检样本；(2)亲和富集前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T1；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T1’；(3)亲和富集后核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在4～8℃温度下孵育10～15min，使核磁共振造影剂与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T2；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4～8℃温度下孵育10～15min，使核磁共振造影剂与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T2’；(4)标准曲线制作与结果得出计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2‑T1，以ΔT2为纵坐标，以标准样本中的目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线；计算待检样本的弛豫时间改变量ΔT2test，所述ΔT2test＝T2’‑T1’，ΔT2test不为0，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲线得出待检样本中目标稀有细胞的含量。...

【技术特征摘要】
2014.07.09 CN 201410326437.41.一种基于磁性微珠的样品无转移低场NMR稀有细胞快速检测方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本制备将纯培养的目标稀有细胞的细胞系，以缓冲液进行不同梯度稀释，制得系列浓度的稀有细胞悬浮液标准样本；对待测生物体液样本进行Ficoll密度梯度离心获取候选混合细胞群，递经洗涤高心重悬，制得稀有细胞悬浮液待检样本；(2)亲和富集前核磁共振弛豫时间检测取上述标准样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T1；取上述待检样本，加入偶联有目标稀有细胞特异表达抗体的核磁共振造影剂，混合均匀后立即用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T1’；(3)亲和富集后核磁共振弛豫时间检测取上述加入核磁共振造影剂的标准样本，在4～8℃温度下孵育10～15min，使核磁共振造影剂与标准样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T2；取上述加入核磁共振造影剂的待检样本，在4～8℃温度下孵育10～15min，使核磁共振造影剂与待检样本中的稀有细胞发生免疫反应富集后，再次用低场核磁共振分析仪进行弛豫时间测定，得弛豫时间值T2’；(4)标准曲线制作与结果得出计算标准样本的弛豫时间改变量ΔT2，所述ΔT2＝T2-T1，以ΔT2为纵坐标，以标准样本中的目标稀有细胞含量为横坐标，绘制成标准曲线；计算待检样本的弛豫时间改变量ΔT2test，所述ΔT2test＝T2’-T1’，ΔT2test不为0，则表明待检样本中含有目标稀有细胞，同时依据上述标准曲线得出待检样本中目标稀有细胞的含量。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：张祥林，
申请(专利权)人：张祥林，
类型：发明
国别省市：上海;31