具有用于定向交联和固定化的热点的生物活性蛋白制造技术

本发明专利技术涉及与天然蛋白相比具有持久稳定性的新颖的生物活性的环突变蛋白，其具有位于远离活性中心处的用于定向固定化和交联性能的热点。本发明专利技术另外涉及遗传工程改造所述生物活性蛋白的方法、以及根据本发明专利技术修饰的其它生物学材料。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及与天然蛋白相比具有持久稳定性的新颖的生物活性的环突变蛋白，其具有位于远离活性中心处的用于定向固定化和交联性能的热点。本专利技术另外涉及遗传工程改造所述生物活性蛋白的方法、以及根据本专利技术修饰的其它生物学材料。【专利说明】具有用于定向交联和固定化的热点的生物活性蛋白
本专利技术涉及与天然蛋白相比具有持久稳定性的新颖的生物活性的环突变蛋白。本专利技术的另一个方面是经由定位环插入遗传工程改造生物活性蛋白、特别是酶的方法。 更具体地，本专利技术涉及与天然蛋白相比具有持久稳定性和活性的新颖的环突变蛋白、特别是酶，其具有位于活性中心远处的用于蛋白的定向固定化和交联的热点。该特定专利技术的另一个方面是经由定位环插入遗传工程改造这些蛋白、优选酶的方法，所述方法用于建立用于定向固定化和交联的热点。
技术介绍
酶是生物催化剂，并且由于它们的高活性、选择性和特异性，它们被广泛地用在工业过程中。在所有酶中，纤维素酶(降解纤维素的酶)正在变成对于生物技术和酶工程而言是非常重要的材料。这是因为纤维素是地球上最丰富的聚合物。纤维素酶正在越来越多地被用于多种工业目的，因此，已经将大量努力付诸它们的表达以及它们的定位诱变研究。 在最近的30年中，纤维素酶在工业过程中的应用已经增加至相当大的量。纤维素酶被广泛地用在纺织品工业中，特别是用于纺织品的生物精处理(b1polishing)以改善织物质量，用于斜纹粗棉布服装的酶洗(b1stoning)以得到流行的老化外观。它们还被广泛地用在饲料、食品工业中，用在纸浆和纸加工中，和用在洗衣店中。在最近的十年中，几项研究聚焦于使用纤维素酶来转化木质纤维素生物质以产生生物燃料作为化石燃料的替代性可再生能源。 许多研究提议使用交联剂来增强酶的稳定性，但是它们似乎对活性具有不利的影响，因为它们靶向也可能存在于活性中心附近的某些类型的氨基酸。已知与戊二醛等试剂交联会通过限制酶的构象柔性(由于与赖氨酸残基的非特异性结合)而降低酶活性(Busto等人,1997 ；Domen 等人,1990)。 通常已知被固定化在支持物上的或交联的酶和其它生物分子具有用作生物传感器或生物催化剂的改善的性能。此外，可以将它们回收用于重复使用。但是，使用可用技术对生物分子的固定化高度依赖于生物分子的性能和固定化支持物或表面的性能。在大多数情况下，固定化或交联会造成酶活性的下降或干扰生物分子的配体结合性能。大多数可用于交联或固定化的方法不会实现定向结合。该事件是一个几乎随机的过程，其中可以从许多不同位点固定目标蛋白，这会造成酶活性的下降。例如，许多研究提议使用交联剂来增强酶的稳定性，但是它们似乎对活性具有不利的影响，因为它们靶向也可能存在于活性中心附近的某些类型的氨基酸(Busto等人，1997 ；Rao等人，1998 ；Yuan等人，1999)。 定向固定化是当前用于克服该生物活性降低的方法。用于固定化或交联的蛋白取向的改变是有问题的，且通常是个案特异性的。在许多情况下，该想法被用于促进从支持物向氧化还原生物传感器中的酶的电子转移(Ferapontova等人，2002)。为此目的，使用革巴酶上的半胱氨酸残基将所述酶固定在含有二硫化物基团或由金制成的支持物上。但是，该方法存在一个重大缺点。并非所有生物分子都含有游离半胱氨酸残基或其位置允许生物分子的定向固定化的半胱氨酸残基。美国专利申请号2009/0120809描述了一种硝基还原酶，其被修饰成包含多个掺入其结构中的半胱氨酸残基，用于将所述酶定向固定化在贵金属电极上。另外，有些研究通过将半胱氨酸残基引入酶表面中解决了该问题(Ferapontova等人，2002 ； Gwen in 等人，2007 ；Kal Iwass 等人，1993 ；Kapp 等人，2006 ； Viswanath 等人，1998)。但是该方法的应用限于不总是有利的二硫化物-硫醇互换化学。 另外，在一些情况下，使用定位诱变技术来直接地改变蛋白取向用于固定化。有些情况涉及定位交换的组氨酸残基或His标签的应用(Nakamura等人，2011 ；Porath等人，1975)。通常将这些固定在固定化的金属螯合物(IMAC)或金支持物上(Andreescu等人，2001)。但是，该方法的一个重要缺点是，在添加竞争性的配体以后，固定化是可逆的(Jerker, 1992)。另外，经常将His-标签添加至目标蛋白的N-或C-末端，因此这可以限制要仅固定化至N-和C-末端上的蛋白的适当取向。这会限制该方法在某些蛋白中的应用，所述蛋白在从N或C-端固定化以后会正确地定向。 某些反应基团在蛋白表面上的富集，是指导生物分子的定向固定化的另一种方法。为此目的，Guisan等人在已经富含Lys基团的青霉素G酰化酶的表面上引入3个赖氨酸残基(Abian等人，2004)。已经证实，乙醛酰基-琼脂糖上的固定化速率增加了超过10倍，并且酶的热稳定性增加。Terreni等人设计了这样的蛋白:其具有在相同酶的β链的C-端末端上与3个甘氨酸交替的3个赖氨酸的标签，所述标签也改善了在PGA上的固定化(Serra等人，2009)。后一种方法具有与使用His标签相同的缺点，因为该方法的应用限于某些蛋白。如果活性中心靠近蛋白的N或C-末端(在此处插入赖氨酸环，从而造成活性的下降)，本申请也可能具有缺点。 前述方法的组合也适用于文献中。例如，PCT专利申请WO 03/044189描述了经修饰的蛋白，即经修饰的HIV-1衣壳蛋白p24，其由包含被称作聚K的核苷酸片段(其编码连续至少6个赖氨酸残基)的核苷酸序列编码，和第二种经修饰的蛋白，其由包含被称作聚H的核苷酸片段(其编码连续至少6个组氨酸残基)的核苷酸序列编码。这些聚赖氨酸和聚组氨酸标签也位于蛋白的N-端或C-端。因此，如早前所述，该方法具有受限的应用。 在本专利技术中，以位于远离蛋白的活性中心的方式插入氨基酸环，以便建立用于交联和固定化的局部闻未和力点。 成功地改善了蛋白、优选酶的操作稳定性。在本专利技术中，生产了经修饰的蛋白，其含有在用于定向固定化或交联的表面上的热点。为此目的，优选地使用定位诱变将富含赖氨酸和甘氨酸的内环(endo-loop)插入酶的表面中，以建立用于固定化和交联的局部高亲和力点。选择的环位置是高度溶剂可接近的且柔性的位点，其位于远离活性中心处，以便不会干扰酶的活性。内环向蛋白的插入是有问题的过程，因为插入的序列可能干扰目标蛋白的合成、折叠途径和总体结构。实际上，在现有技术所报道的那些试验中，证实了内环突变蛋白是边缘功能性的或完全功能失调的(Amatore和Baneyx, 2003 ；Doi等人，1997 ；Doi等人，1998 ;Heinis等人，2006 ;Manoil和Bailey, 1997)。在与现有技术的惊人对比中，发现本专利技术的内环突变体酶是完全功能性的，其含义是，这样的突变体与野生型酶相比已经保留所有生物活性。在许多情况下，还注意到与天然酶相比折叠状态的持久稳定性。
技术实现思路
在本专利技术中，包括与天然蛋白相比具有持久稳定性和活性的新颖环突变蛋白，其具有位于远离活性中心处的热点，以便提供蛋白的定向固定化和交联。 具体地，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
生物活性的突变蛋白，其包含对应天然蛋白的所有必需三级结构元件和至少一个表面暴露的非天然结构元件，其特征在于，所述非天然结构元件位于蛋白一级结构内并且形成表面暴露的肽环，所述肽环用于建立热点以允许定向蛋白固定化和折叠的蛋白三级结构的增强稳定性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥斯曼·尤格·赛泽曼，刚塞利·贝拉姆·阿克卡皮纳，
申请(专利权)人：萨班哲大学，
类型：发明
国别省市：土耳其;TR