一种脂质代谢网络动态研究的方法技术

本发明专利技术公开了一种脂质代谢网络动态研究的方法，该方法是基于稳定同位素标记辅助的脂质组学，并结合非靶向的同位素异构体筛选。其特征在于，结合稳定同位素标记的细胞、动物或人体的实验，高分辨的超高效液相色谱-质谱联用(high resolution-UHPLC-MS)的脂质组学分析，非靶向的同位素异构体筛选，在获得静态脂质代谢指纹的同时，可以捕获包含其中的动态代谢过程（如脂质分子的合成、转化、分解等过程）。本发明专利技术具有高度的分子特异性和广泛的网络覆盖能力，方法重复、稳健、可靠。该方法为深入研究脂质代谢开辟了新思路，以期对生物体系的病理生理过程、代谢扰动获得更深刻全面的理解。

【技术实现步骤摘要】
一种脂质代谢网络动态研究的方法
本专利技术涉及分析化学和生物化学领域，是一种基于稳定同位素标记辅助的脂质组学并结合非靶向的同位素异构体筛选，用于脂质代谢网络的动态研究的新方法。
技术介绍
脂质是一类重要的代谢物，除了储存能量外，是细胞膜结构的重要组成成分，也是调节各类信号过程的关键因子。脂质代谢的失调与多种疾病的发生、发展有关。脂质组学（Lipidomics）是研究脂质代谢的有力手段。然而大部分的脂质组学组学只能获取到“快照式（snapshot）”的静态脂质轮廓，无法对脂质代谢的动态过程（如合成、转化、降解等）进行深入研究。将稳定同位素标记的前体分子引入到实验体系中，可以捕获脂质代谢动态过程。经典方法有气相色谱-同位素比例质谱（gas-chromatography-isotoperatiomassspectrometry,GC-IRMS）、基于气相色谱-质谱联用（gas-chromatographycoupledwithmassspectrometry,GC-MS）的质量同位素异构体分布分析（massisotopomerdistributionanalysis,MIDA）。然而这些方法涉及的GC-MS分析前的样品预处理复杂繁琐，并且无法从分子水平上实现MID分析。采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的分析手段通过二级质谱实验（MS/MS）显著提高了同位素富集研究的分子特异性。目前有报道，通过测定胆固醇酯（cholesterolesters）、磷脂（phospholipid）、三酰甘油（triacylglycerol）、鞘脂（sphingolipid）或酯酰辅酶A（acyl-coA）等脂质库对外源性稳定同位素的吸收,来研究在饮食或药物干预下的脂质代谢应答；或利用稳定同位素标记追踪脂肪酸碳链的延长和降解。这些研究大大开拓了人们对脂质代谢的认识。然而，到目前为止，这些研究只关注某一类或某几种的脂质，缺少一种非靶向的策略，可以实现对尽可能多的标记脂质的检测和覆盖，从而进一步获取细胞、体液或组织中脂质代谢动态过程的复杂信息。鉴于此，我们提出一种基于稳定同位素标记辅助的脂质组学并结合非靶向的同位素异构体筛选，用于脂质代谢网络的动态研究的新方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，提出一种脂质代谢网络动态研究的方法，该方法是基于稳定同位素标记辅助的脂质组学，并结合非靶向的同位素异构体筛选。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案和技术步骤如下：第一步，将稳定同位素标记的脂质合成前体分子（常用有13C全标记的棕榈酸或油酸）引入生物体系中。实验体系包括细胞模型，植物、动物模型或人体的在体模型，通过如培养基、饮食、注射等方式在各个相应模型中引入稳定同位素标记的脂质合成前体分子；第二步：脂质提取物用超高效液相色谱-高分辨质谱联用(UHPLC-highresolutionMS)以全扫描的形式进行脂质组学数据采集。第三步：将得到的脂质组学原始数据进行峰匹配和特征提取后，得到包含各个样品的所有离子的保留时间（tR）、质荷比（m/z）以及强度的峰表，并进行初步数据预处理，包括修正80%原则除去缺失值（参考文献1：Bijlsma,S.;Bobeldijk,L.;Verheij,E.R.;Ramaker,R.;Kochhar,S.;Macdonald,I.A.;vanOmmen,B.;Smilde,A.K.AnalyticalChemistry2006,78,567-574.），QC重复性考察除去变异系数大的离子（参考文献2：Gika,H.G.;Theodoridis,G.A.;Wingate,J.E.;Wilson,I.D.JournalofProteomeResearch2007,6,3291-3303.）。第四步：从处理后的峰表信息中筛选出同源的标记了完整的初始前体分子的同位素异构体（isotopomer），即标记的同位素异构体含有的稳定同位素个数为前体分子中的稳定同位素个数或其整数倍，如，采用13C全标记的棕榈酸，相应的同位素异构体含有至少一个13C16，并将同源的，即属于同一个标记脂质的所有筛选所得同位素异构体归属到同一个标记脂质分子；筛选原则包括：1）根据所采用的标记前体分子，同源的同位素异构体系列的理论m/z差为固定值，在实验测定中允许一定误差范围，在高分辨质谱下允许±0.005～±0.001的误差范围；2）同源的同位素异构体的理论保留时间tR完全对齐，在实验测定中允许一定漂移范围，在可重复的色谱行为下允许±0.1min以内；3）各个同位素异构体由于同位素富集程度（如13C富集度）的不同，同位素模式（isotopicpattern）也不同；4）稳定同位素标记的同位素异构体在空白对照中检测不到；根据上述筛选原则，从峰表数据中提取出同源的标记了完整的初始前体分子的同位素异构体，并归属于同一个标记脂质分子。如在采用[U-13C]-palmitate为前体分子的例子中，同源的同位素异构体系列的m/z差=16×（13C-12C）=16.0536；该步骤筛选出一系列的同源同位素异构体，包括，M（天然不标记形式的脂质分子），M+16（13C16标记形式），M+32（13C32标记形式），M+48（13C48标记形式）系列同位素异构体离子，并进行匹配。第五步：在第四步基础上筛选出标记了前体分子代谢中间体的脂质同位素异构体，筛选原则包括：1）标记了前体分子代谢中间态的同位素异构体，与第四步中筛选出的同源离子，m/z差是基于可能的中间代谢过程所导致的碳链的长度变化，如脂肪酸链的缩短或延长；并在实验测定中允许一定误差范围，在高分辨质谱下允许±0.005～±0.001的误差范围2）所有同源同位素异构体的理论保留时间tR完全对齐，在实验测定中允许一定漂移范围，在可重复的色谱行为下允许±0.1min以内；3）各个同位素异构体由于同位素富集程度（如13C富集度）的不同，同位素模式（isotopicpattern）各不同；4）稳定同位素标记的同位素异构体在空白对照中检测不到；根据上述筛选原则，从峰表数据中提取除同源的标记了前体分子的代谢中间体的同位素异构体，并合并第四步中筛选得的标记了完整前体分子的同位同位素异构体，进行匹配。如在以[U-13C]-palmitate为标记前体分子的例子中，筛选出M+12（13C12标记形式），M+14（13C14标记形式），M+18（13C18标记形式），M+20（13C20标记形式），M+28（13C28标记形式），M+30（13C30标记形式），M+34（13C34标记形式），M+36（13C36标记形式），M+44（13C44标记形式），M+46（13C46标记形式），M+50（13C50标记形式），M+52（13C52标记形式）系列同位素异构体离子，并将所有的同源离子（包括第四步筛选出的离子）进行匹配，归属到同一个标记脂质分子。第六步，基于精确m/z、二级质谱（MS/MS）和数据库LIPIDMAPS，HMDB搜索所得的定性结果（分子式，含13C标记个数）和13C的天然丰度（1.08%），对同位素异构体的丰度进行天然同位素的校正，并进行质量同位素异构体分布分析（massisotopomerdistribut本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂质代谢网络动态研究的方法，是基于稳定同位素标记辅助的脂质组学并结合非靶向的同位素异构体筛选，其特征在于：第一步，将稳定同位素标记的脂质合成前体分子引入生物体系中;第二步，脂质提取物用超高效液相色谱‑质谱联用(UHPLC‑MS)进行脂质组学数据采集;第三步，将得到的脂质组学原始数据进行峰匹配和特征提取后，得到包含各个样品的所有离子的保留时间（tR）、质荷比（m/z）以及强度的峰表，并进行初步数据预处理;第四步，从处理后的峰表信息中，筛选出标记了完整的原始前体分子的脂质同位素异构体（isotopomer），并将同源的，即属于同一个标记脂质的所有筛选所得同位素异构体归属到同一个标记脂质分子;第五步，在第四步基础上筛选出标记了前体分子代谢中间体的脂质同位素异构体，并合并第四步筛选所得离子，将所有同源的同位素异构体归属到同一个标记脂质分子;第六步，对筛选得到的同位素异构体进行天然同位素的校正，并进行质量同位素异构体分布分析（mass isotopomer distribution analysis，MIDA）;第七步，计算所有检测到的脂质的整体脂质丰度（静态轮廓），标记脂质的同位素标记摩尔百分比（动态同位素富集）。...

【技术特征摘要】
1.一种脂质代谢网络动态研究的方法，是基于稳定同位素标记辅助的脂质组学并结合非靶向的同位素异构体筛选，其特征在于：第一步，将稳定同位素标记的脂质合成前体分子引入生物体系中；第二步，脂质提取物用超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS)进行脂质组学数据采集；第三步，将得到的脂质组学原始数据进行峰匹配和特征提取后，得到包含各个样品的所有离子的保留时间(tR)、质荷比(m/z)以及强度的峰表，并进行初步数据预处理；第四步，从处理后的峰表信息中，筛选出标记了完整的原始前体分子的脂质同位素异构体(isotopomer)，并将同源的，即属于同一个标记脂质的所有筛选所得同位素异构体归属到同一个标记脂质分子；第五步，在第四步基础上筛选出标记了前体分子代谢中间体的脂质同位素异构体，并合并第四步筛选所得离子，将所有同源的同位素异构体归属到同一个标记脂质分子；第六步，对筛选得到的同位素异构体进行天然同位素的校正，并进行质量同位素异构体分布分析(massisotopomerdistributionanalysis，MIDA)；第七步，计算所有检测到的脂质的整体脂质丰度，即其静态轮廓；计算标记脂质的同位素标记摩尔百分比，即其动态同位素富集。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于；第一步中，稳定同位素标记的脂质合成前体分子为13C标记；稳定同位素标记的实验体系包括细胞、植物、动物模型或人体的在体模型，通过于细胞模型培养基中添加、植物培养体系中添加，动物模型或人体饮食中添加或注射方式在各个相应模型中引入稳定同位素标记的脂质合成前体分子；此外还需要不含稳定同位素标记前体分子的的细胞、植物、动物模型或人体样本作为空白对照。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：第二步中，采集脂质组学数据的质谱需为高分辨质谱，扫描模式为全扫描，采集的质谱数据的质量精度和分辨率将直接影响后续的筛选结果。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：第三步中，原始峰表的预处理包括修正80％原则除去缺失值，QC重复性考察除去变异系数大的离子。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：第四步中，筛选同源的标记了完整的初始前体分子的同位素异构体，筛选原则包括：1)根据所采用的标记前体分子，同源的同位素异构体系列的理论...

【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，李佳，赵欣捷，陈世礼，曾仲大，路鑫，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21