本发明专利技术公开了一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法；该方法包括如下步骤：在色谱柱中填充抗对流介质；沿纵向填充色谱柱制作pH逐渐变化的缓冲液，使在色谱柱中形成从入口到出口pH值逐渐变化；将样品加到入口处，外加与色谱柱内流体流动方向平行的电场，发生电聚焦；不断加入终止pH值缓冲液，使pH梯度随缓冲液逐渐向柱出口迁移，并将聚焦在不同pH处的样品洗脱出色谱柱；流出色谱柱的缓冲液进入在线检测及收集器，实现在线收集。本发明专利技术利用小分子有机酸、有机碱制作不同的pH缓冲液，并在色谱柱中制作pH梯度缓冲液带，通过外加电场实现两性物质的聚焦分离，为具有两性的极性小分子物质提供了同时实现分离和浓缩的半制备技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及两性物质的高效分离技术，具体涉及一种无需两性电解质的分离两性 物质的电聚焦方法。
技术介绍
IEF是20世纪60年代中期问世的一种利用pH梯度介质分离PI不同的蛋白质的 电泳技术。由于其分辨率可达〇. 01个pH单位，特别适合于分离分子量相近而pi不同的蛋 白质组分。IEF需要在一定抗对流介质（如凝胶）中加入特殊两性电解质，同时在正极端吸 入酸液，如硫酸、磷酸或乙酸等，在负极端引入碱液，如NaOH溶液、氨水等。当外加电场时， 电解质和两性样品开始移动，混合物中pH最低的两性电解质分子，带负电荷最多，向正极 移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，这一分子不再向前移动而停 留在此区域内。这类方法必需使用两性电解质，因为两性电解质具有一定的缓冲能力，使其 周围一定的区域内的pH保持在其等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质，也移向正极， 定位于第一种两性电解质之后。这样，经过一定时间后，具有不同pi的两性电解质按各自 的pi依次排列，形成了从正极到负极pH值逐步上升的梯度，两性样品也被富集在与其pi 相等的区域，从而按照pi分离。这一技术的分辨率高，且有浓缩效应，用于许多蛋白质样 品的纯度分析或分离纯化。但不能进行样品的在线收集，需要将含有样品的凝胶带切割后 再洗脱，操作繁琐，耗时长，而且两性电解质价格较贵，因此该法没有得到广泛应用，目前主 要用于分离Pi接近且价值较高的蛋白质样品。通过对现有文献的检索发现，中国专利技术专利 CN103235026A公开了一种蛋白质等电聚焦电泳的方法及其装置；是关于蛋白质、核酸等大 分子样品的等电聚焦装置和方法，该方法需要两性电解质构建pH变化的区带，从而实现等 电聚焦；样品最终聚焦在抗对流介质中，同样不能实现样品的在线收集。 开发高效、稳定、自动化、样品覆盖范围广的制备型分离技术，是生物医药产品低 成本、高效产业化之关键。越来越多的活性小分子极性物质被发现，例如，活性小肽、寡糖、 小分子核苷酸、有机酸。然而，这些物质的制备分离存在技术难点，这些物质因不能在反相 色谱柱上有效保留而不能被常规液相色谱分离纯化[Strege MA. Hydrophilic interaction chromatography-electrospray mass spectrometry analysis of polar compounds for natural product drug discovery[J]. Anal Cheml998,70 (13) :2439-2445.]； [Jiang Z, Smith NW, Ferguson PD, et al. Hydrophilic interaction chromatography using methacrylate-based monolithic capillary column for the separation of polar analytes[J]·Anal Chem2007,79 :1243-1250. ] ;[Strege MA，Stevenson S， Lawrence SM. Mixed-mode anion-cat ion exchange/hydrophilic interaction liquid chromatography-electrospray mass spectrometry as an alternative to reversed phase for smal 1 molecule drug discovery [J]· Anal Chem2000, 72 :4629-4633]。虽然离子交换 色谱可以满足离子型化合物的分离，但不能同时分离非极性化合物，高盐洗脱液还增加除 盐负担[JonesIL, Carta G. Ion exchange of amino acids and dipeptides on cation resins with varying degree of crosslinking. 1. Equilibrium[J]. Ind Eng Chem Resl993,32 ： 107-117]。 通常，非常复杂的样品，尤其是生物样品在分析之前必须经过分离和浓缩。IEF可 以同时实现样品的分离和浓缩，是非常有效的分离手段，目前主要用于蛋白质的分离中。然 而，已有的成熟的IEF必需引入两性电解质制作pH梯度，从而混在被分离的样品收集管中， 对分析造成基质干扰效应。IEF技术通常用于蛋白质、多肽样品的分离制备，然而，很多极性 小分子药物，例如，头孢菌素类抗生素也具有两性的特点，如果将IEF用于相关新药开发领 域，具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种无需两性电解质的 分离两性物质的电聚焦方法。本专利技术利用简单的小分子有机酸、有机碱制作不同的pH缓 冲液，并在常用的小分子制备色谱柱中人工制作pH梯度缓冲液带，通过外加电场实现两性 物质的聚焦分离，为具有两性的极性小分子物质提供一种同时实现分离和浓缩的半制备技 术；尤其可以用于这类样品的精制。 本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的： 本专利技术涉及一种，所述方法包括如 下步骤： A、在色谱柱中填充抗对流介质； B、沿纵向填充色谱柱制作pH逐渐变化的缓冲液，使在色谱柱中形成从入口到出 口 pH值逐渐变化； C、将样品加到色谱柱入口处，外加与色谱柱内流体流动方向平行的电场，使样品 在柱内电聚焦； D、不断加入pH值继续变化的缓冲液，使得pH梯度随着缓冲液流动逐渐向柱出口 迁移；将聚焦在不同pH处的样品洗脱出色谱柱； E、流出色谱柱的缓冲液进入在线检测及收集器，实现在线收集。 优选地，步骤A中，所述抗对流介质与样品间无吸附作用或吸附作用微弱。从而使 样品主要受电场力作用。 优选地，所述抗对流介质为色谱填料；所述色谱填料包括葡聚糖凝胶颗粒或反相 色谱填料。 优选地，步骤B中，所述pH逐渐变化是连续变化或阶段变化；所述pH范围根据被 分离样品的等电点范围选取。 优选地，所述pH逐渐变化的缓冲液是由小分子弱酸和弱碱按照不同配比，制作不 同pH值缓冲液，并依次加入色谱柱而形成的。 优选地，所述小分子弱酸为乙酸；所述小分子弱碱为氨水。 优选地，步骤C中，外加电场方向由从柱入口到出口的pH变化方向决定；如果柱入 口的pH值高于柱出口，则入口处连接高压电源负极，出口处连接高压电源正极。反之亦然。 从而使样品在色谱柱中随缓冲液缓慢移动的同时，能够受电场作用聚焦在pH与pi相当的 缓冲液条带区域。 优选地，步骤D中，如果柱入口的缓冲液pH值高于柱出口，则所述pH值继续变化 的缓冲液的pH值等于或高于柱入口的缓冲液pH值；如果柱入口的缓冲液pH值低于柱出 口，则所述pH值继续变化的缓冲液的pH值等于或低于柱入口的缓冲液pH值。该pH值继 续变化的缓冲液可以是pH逐渐变化的缓冲液，也可以是单一的终止缓冲液。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果： (1)可以使用低浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A、在色谱柱中填充抗对流介质；B、沿纵向填充色谱柱制作pH逐渐变化的缓冲液，使在色谱柱中形成从入口到出口pH值逐渐变化；C、将样品加到色谱柱入口处，外加与色谱柱内流体流动方向平行的电场，使样品在柱内电聚焦；D、不断加入pH值继续变化的缓冲液，使得pH梯度随着缓冲液流动逐渐向柱出口迁移；将聚焦在不同pH处的样品洗脱出色谱柱；E、流出色谱柱的缓冲液进入在线检测及收集器，实现在线收集。
【技术特征摘要】
1. 一种无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于，所述方法包括如 下步骤： A、 在色谱柱中填充抗对流介质； B、 沿纵向填充色谱柱制作pH逐渐变化的缓冲液，使在色谱柱中形成从入口到出口 pH 值逐渐变化； C、 将样品加到色谱柱入口处，外加与色谱柱内流体流动方向平行的电场，使样品在柱 内电聚焦； D、 不断加入pH值继续变化的缓冲液，使得pH梯度随着缓冲液流动逐渐向柱出口迁移； 将聚焦在不同pH处的样品洗脱出色谱柱； E、 流出色谱柱的缓冲液进入在线检测及收集器，实现在线收集。2. 如权利要求1所述的无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于， 步骤A中，所述抗对流介质与样品间无吸附作用或吸附作用微弱。3. 如权利要求2所述的无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于， 所述抗对流介质为色谱填料；所述色谱填料包括葡聚糖凝胶颗粒或反相色谱填料。4. 如权利要求1所述的无需两性电解质的分离两性物质的电聚焦方法，其特征在于， 步骤B中，所述pH逐渐变化是连续变化或阶段变化；所述pH范围根据被...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯蕾，赵凤生，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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