本发明专利技术提供一种生产β-檀香萜的方法，所述方法包含将至少一种多肽与法呢基焦磷酸酯(FPP)接触。具体地，所述方法可在体外或体内生产香料和调味料领域非常有用的化合物—β-檀香萜。本发明专利技术还提供了在用于本发明专利技术方法中的多肽的氨基酸序列。本发明专利技术的又一部分是编码本发明专利技术多肽的核酸以及含有所述核酸的表达载体。本发明专利技术的又一目的是用于生产β-檀香萜的方法的经转化的非人宿主生物体或细胞。
【技术实现步骤摘要】
用于生产β-擅香萜的方法本专利技术是2009年12月9日申请的专利技术名称为“用于生产β_檀香萜的方法”的第200980149896.7号专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术提供一种生产β -檀香萜的方法，所述方法包括将至少一种多肽与法呢基焦磷酸酯(FPP)接触。特别是，所述方法可以在体外或体内进行以产生β_檀香萜，其是一种在香料和调味料领域中非常有用的化合物。本专利技术还提供可用于本专利技术方法的多肽的氨基酸序列。编码本专利技术多肽的核酸和含有所述核酸的表达载体也是本专利技术的一部分。本专利技术的另一个目的是一种经转化以在生产β-檀香萜的方法中使用的非人宿主生物体或细胞。
技术介绍
已经在大多数生物体(微生物、动物和植物)中发现了萜。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元组成，并按由结构之中存在的这些单元的数目来进行划分。因此单萜、倍半萜和双萜分别是包含10、15和20个碳原子的萜。例如，倍半萜已广泛见于植物界。许多倍半萜分子因它们的调味料和香味性质以及它们的美容、医药和抗菌效果而众所周知。已经鉴定出了 300多种倍半萜烃类和3000多种倍半萜化合物(Joulain, D.,和 Kdnig, W.A., The Atlas of Spectral Data of SesquiterpeneHydrocarbons,EB Verlagj Hamburg, 1998 ；Connolly,J.D.，Hill R.A.，Dictionary ofTerpenoids, Vollj Chapman and Hall (publisher), 1991)，并且每年还鉴定出许多新的结构。将通过不同方式如蒸汽蒸馏或溶剂萃取获得的植物提取物用作萜源。萜分子往往原样使用，但是有时候使用化学 反应将该萜转化成其它的高价值分子。萜的生物合成生产涉及的酶被称为萜合酶。事实上植物界中存在大量的倍半萜合酶，其全部使用相同的底物(法呢基焦磷酸酯，FPP)但是具有不同的产物分布。已经克隆了编码倍半萜合酶的基因和cDNA并且描述了相应的重组体酶。在植物中及其他生物体中的職的生物合成已经被广泛研究，在此不另外详述，但可参考Dewick的Nat.Prod.Rep.,2002，19，181-222，其综述了萜生物合成路径的现有技术的状况。β -檀香萜是天然生成的倍半萜分子，其可以被用作化学合成或生物合成β -檀香醇(如图2Β所示)的起始原料，该檀香醇为檀香油的主要组分。通过蒸馏檀香物种的心材获得的檀香油是重要的香料成分。檀香也被大量用于熏香和传统医学。该油包含90%的倍半萜醇。在不同的檀香醇的异构体中，β_檀香醇对于典型的檀香油的甜木香和香脂气味起到主要贡献。其它组分例如表檀香醇和α-檀香醇可同样有助于檀香木气味。通常，植物天然提取物的价格和可用性取决于植物的丰度、油的收率和地理来源。另外，天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候及其他当地条件，使得某些年在高品质香料中使用上述成分非常困难，甚至不可能使用。由于过度开发自然资源、难以耕作、檀香植物的缓慢生长，在过去的十年期间檀香原料的可获性已经显著地减少。因此，有利的是提供一种β-檀香醇的来源，其更少地受可获性和品质的波动的影响。檀香倍半萜组分的化学合成迄今为止是不可利用的。因此合成β-檀香萜(然后其可被用于生产β-檀香醇)的生物化学途径很受关注。在若干植物品种中鉴定出檀香烷型倍半萜、特别是具有β_檀香烷骨架的倍半萜。但是还未有能合成檀香萜的倍半萜合酶的记载。在国际专利申请W02006/134523中公开了一种能够合成至少一种双环和/或三环的具有檀香烷碳骨架的倍半萜的倍半萜合酶、相应的核酸和具有檀香烷碳骨架的该化合物的制备方法。但是，在其实施例中公开的倍半萜合酶产物中并没有检测到β_檀香萜的踪迹，仅有的具有檀香烷骨架的产物为表-β-檀香萜。表檀香萜的性质与檀香萜的性质悬殊。特别是，在檀香醇的合成过程中表檀香萜不是重要的。此外，在W02006/134523中公开的倍半萜合酶仅仅与本专利技术序列共有27%的同一性。从数据库中公知的倍半萜合酶和本专利技术的多肽的同一性的比率非常低。与本专利技术的β -檀香職合酶最接近的蛋白序列是来自于白檀(Santalum album)(检索号ACF24767 ； Jones, C.G.，Keeling, C.1.，Ghisalbertij E.L.，Barbour, E.L.，Plummer, J.A.和 Bohlmannj J.Arch.Biochem.Biophys.，2008，477 (I)，121-130)的单胳合酶，其与本专利技术的β_檀香萜合酶具有58%的氨基酸序列同一性。当与FPP接触之后，该酶产生超过90%的β_红没药烯并且没有檀香萜异构体形成。除序列本身之间的差异之外，还应指出的是，由上述酶合成的产物的结构和性质与倍半萜β-檀香萜的结构和性质相差悬殊。特别是由该酶产生的单萜，即α-松油萜、柠檬稀、香茅醇、月桂烯、里哪醇和其它一些单体产物都不适合作为香料领域非常有用的成分β-檀香醇的合成的起始原料。尽管广泛研究了萜的环化，但是由于它们的低丰度、通常的瞬时表达模式和在其表达组织中从树脂和酚类化合物的混合物中纯化它们的复杂性的原因，萜合酶的分离和表征仍然是困难的，尤其是在植物中。本专利技术的目的是，如上所指出的，提供以经济的方式生产檀香萜的方法。因此，本专利技术的目的是生产β_檀香萜，同时有极少的浪费的方法、其节约能源和资源并同时减少了对化石燃料的依赖性。本专利技术的另一目的是提供能够合成可用作香料和/或芳香成分的檀香萜的酶。使用的缩写ACC 1-氨基环丙烷甲酸bp 碱基对kb 千碱基BSA 牛血清清蛋白2, 4D 2，4-二氯苯氧基乙酸DNA 脱氧核糖核酸cDNA 互补 DNAdNTP脱氧核苷三磷酸DTT 二硫苏糖醇EDTA 乙二胺四乙酸FPP 法呢基焦磷酸酯GC 气相色谱IPTG异丙基-D-硫代半乳糖苷Kin 细胞分裂素LB 溶菌肉汤MS 质谱PCR 聚合酶链式反应RMCE重组酶介导的盒式交换3’ -/5’ -RACE 3’ 和 5’ cDNA 末端快速扩增RNA 核糖核酸mRNA 信使核糖核酸RNAse 核糖核酸酶
技术实现思路
本专利技术提供一种使用具有β_檀香萜合酶活性的多肽以经济、可靠并且可再现的方式生物合成生产β-檀香職的方法。由于现有技术未曾记载过该多肽并且未曾描述过该β_檀香萜的生物合成，本专利技术是特别有价值的。本专利技术解决了对于香料业工业非常有用的化合物檀香萜的供给的非常重要的难题。本专利技术还提供一种与所述多肽密切相关的编码本专利技术方法中使用的多肽的核酸序列。多肽和核酸是非常重要的工具，它们同为实施本专利技术所必需的。对于用本专利技术的核酸进行修饰以异源表达本专利技术的多肽的载体和生物体来说也是同样的。“倍半萜合酶”或“具有倍半萜合酶活性的多肽”是用于本专利技术目的作为能够催化从无环萜前体FPP合成倍半萜分子或倍半萜分子混合物的多肽。作为“ β -檀香萜合酶”或“具有β -檀香萜合酶活性的多肽”，此处我们是指能够催化从FPP开始合成任何立体异构体或其混合物形式的β -檀香萜的多肽。β -檀香萜可以是唯一的产物或可以是倍半萜混合物的一部分。β_檀香萜以图2Α所示的结构来定义。多肽催本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产β‑檀香萜的方法，包含：a)使FPP与至少一种具有β‑檀香萜合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列；b)非强制选择地，分离在步骤a)中产生的β‑檀香萜。
【技术特征摘要】
2008.12.11 EP 08171298.6;2009.08.17 IB PCT/IB2009/1.一种生产β-檀香萜的方法，包含: a)使FPP与至少一种具有β-檀香萜合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列； b)非强制选择地，分离在步骤a)中产生的β_檀香萜。2.权利要求1所述的方法，其中步骤a)包含在有利于生产檀香萜的条件下培养能够生产FPP并且经转化以表达至少一种多肽的非人宿主生物体或细胞，其中该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有β -檀香萜合酶活性。3.权利要求2所述的方法，其中该方法还包含在步骤a)之前用至少一种编码多肽的核酸将能够生产FPP的非人生物体或细胞转化以使所述生物体表达所述多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有β -檀香萜合酶活性。4.权利要求3所述的方法，其中所述至少一种编码β-檀香萜合酶的核酸包含与SEQID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列有至少50%、优选至少60%、优选至少70%、优选至少90%同一'丨生的核苷酸序列。5.权利要求2~4中任一项所述的方法，其中非人宿主生物体为植物、原核生物或真菌。6.权利要求5所述的方法，其中非人宿主生物体为微生物，优选细菌或酵母。7.权利要求6所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌并且所述酵母为酿酒酵母。8.具有β-檀香萜合酶活性并且包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽。9.编码权利要求8所述的多肽的核酸。10.权利要求9所述的核酸，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·沙尔克，
申请(专利权)人：弗门尼舍有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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