一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)采集船舶压载舱的沉积物，置于培养皿内；(2)用过滤海水冲洗沉积物，并采用第一筛绢过滤，保存冲洗后的液体；(3)将保存的液体采用第二筛绢过滤，保留所述第二筛绢上的残留物；(4)用饱和蔗糖溶液冲洗所述第二筛绢上的残留物至离心管；(5)将所述离心管离心；(6)吸取所述离心管的上清液，采用第三筛绢过滤，保留所述第三筛绢上的残留物；(7)用过滤海水漂洗所述第三筛绢上的残留物至培养皿中，实现活体细胞的分离，在显微镜下观察活体细胞。本发明专利技术所述方法步骤简单、操作简便、可以实现分离快速。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法。
技术介绍
外来生物入侵对我国生态环境和社会发展构成严重威胁，造成了重大的经济损失，抵御外来生物入侵，保护国境安全，是出入境检验检疫刻不容缓的职责和义务。随着海上航运业的快速发展，船舶压载水及沉积物带来的海洋生物入侵问题日益严重，海洋生物入侵会破坏海洋生态系统结构与功能，并造成一定的经济损失。船舶压舱水及沉积物携带的海洋生物可以存活数月，并随着压舱水的排放而进入其他水域，这为不同水域间一些物种的传播提供了一个便利的媒介。外来物种在新的适宜生存环境中的异常繁殖，会对近岸水域的生态系统带来灾难性破坏，甚至导致本土物种的灭绝。20世纪60年代以来北美五大湖共发现40余个外来物种，而旧金山湾在1970年后出现了 50多种外来生物。为防止船舶通过压载水及沉积物转移外来生物和病原体，国际海事组织制定《船舶压载水及沉积物控制和管理国际公约》及相关导则。海洋浮游动物如枝角类、桡足类等，在其生活史阶段会产生休眠细胞以度过不良环境条件，因此可以长时间在船舶压载舱沉积物中存活。如Kelly对从日本到达美国塔克马和安吉里斯港的木材运输船中的压载水沉积物进行了检测，其中也发现了存活的软体动物幼体和浮游甲壳纲动物。Bailey对进入大湖区9艘船舶压载舱沉积物中的休眠细胞萌发进行了实验，在孵化出的浮游动物种类中发现4种外来入侵生物。目前对沉积物中外来生物的鉴定多依赖于实验室原位萌发实验，对沉积物中休眠细胞萌发后的浮游动物幼体进行形态学鉴定，从而判定是否为入侵生物。该方法耗费时间长，并且要求检验检疫人员具有丰富的生物学分类经验，严重制约船舶压载舱沉积物中外来生物检验检疫工作的开展。而从船舶压载舱沉积物中分离活体细胞并进行分子生物学鉴定，将大大缩短对船舶压载舱沉积物中外来入侵生物进行种类鉴定的时间。由于浮游动物休眠细胞个体微小(多为直径几十微米)，从船舶沉积物压载舱沉积物中分离活体细胞十分困难，因此急需建立一种从船舶压载舱沉积物中快速分离活体细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种步骤简单、操作简便、检测快速精确的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法。—种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，包括如下步骤:(I)采集船舶压载舱的沉积物，置于培养皿内；(2)用过滤海水冲洗沉积物，并采用第一筛絹过滤，保存冲洗后的液体； (3)将保存的液体采用第二筛絹过滤，保留所述第二筛絹上的残留物；(4)用饱和蔗糖溶液冲洗所述第二筛絹上的残留物至离心管；(5)将所述离心管离心；(6)吸取所述离心管的所有上清液，采用第三筛絹过滤，保留所述第三筛絹上的残留物；(7)用过滤海水漂洗所述第三筛絹上的残留物至培养皿中，实现活体细胞的分离，在显微镜下观察活体细胞。本专利技术所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中所述第一筛絹的孔径为200~250微米，所述第二筛絹和所述第三筛絹的孔径为30~50微米。本专利技术所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(4)中所述饱和蔗糖溶液的浓度为200-220克蔗糖/100毫升蒸馏水。本专利技术所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(5)中的所述离心米用台式离心机，转速为1000-1200rpm,离心时间为3-5分钟。本专利技术所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(2)和(7)中的过滤海水为0.15微米滤膜过滤后的海水。本专利技术所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其中步骤(1)中称取5克所述沉积物置于培养皿内，步骤(2)和步骤(7)中的过滤海水的用量均为100毫升，步骤(4)中所述饱和蔗糖溶液用量为100毫升。本专利技术船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法与现有技术不同之处在于:本专利技术船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法能够从船舶压载舱沉积物中快速分离活体细胞，步骤简单，可以实现分离快速，所分离的活体细胞样品可用于出入境检验检疫工作中外来入侵生物的分子生物学物种鉴定。本专利技术船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法步骤(2)中采用0.45微米滤膜过滤后海水冲洗是为了去除自然海水中大于0.45微米的活体细胞，防止外来污染；采用第一筛絹过滤目的是去除大于200-250微米的杂质；步骤(3)中残留物是指直径介于30-50微米到200-250微米之间，包括活体细胞、泥沙颗粒等杂质；步骤(4)中浓度为200-220克蔗糖/100毫升蒸馏水的饱和蔗糖溶液分离效果好，并且不会将活体细胞挤压变形；此步骤中筛絹上残留物包括活体细胞、泥沙颗粒等杂质，这一步骤主要是将残留物混合到饱和蔗糖溶液；步骤(5)中离心主要去除泥沙颗粒等杂质，上清液里主要是活体细胞，底部沉淀是泥沙颗粒等杂质；步骤(6)中过筛絹的目的是分离活体细胞和液体。【具体实施方式】实施例1对停靠在烟台芝罘港的船舶压载舱沉积物样品进行活体细胞的快速分离的方法，包括如下步骤:(I)米集船舶压载舱沉积物，取5克沉积物放置于培养皿内；(2)用100毫升0.45微米过滤海水冲洗沉积物，采用200微米孔径的第一筛絹过滤，用塑料瓶保存冲洗过滤后的液体； (3)将塑料瓶中保存的液体采用50微米孔径的第二筛絹过滤，保留第二筛絹上的残留物；(4)用100毫升浓度为200-220克蔗糖/100毫升蒸馏水的饱和蔗糖溶液冲洗第二筛絹上的残留物至离心管中；(5)将所述离心管在台式离心机上1000rpm条件下离心3分钟；(6)吸取所述离心管的所有上清液，上清液采用50微米孔径的第三筛絹过滤，保留所述第三筛絹上的残留物；(7)用100毫升0.45微米滤膜过滤后的过滤海水漂洗第三筛絹上的残留物至培养皿中，实现分离，在显微镜下观察活体细胞。实施例2对停靠在烟台龙口港的船舶压载舱沉积物样品进行活体细胞的快速分离，包括如下步骤:(I)米集船舶压载舱沉积物,取5克沉积物放置于培养皿内；(2)用100毫升0.45微米过滤海水冲洗沉积物，采用200微米孔径的第一筛絹过滤，用塑料瓶保存冲洗过滤后的液体；(3)将塑料瓶中保存的液体采用40微米孔径的第二筛絹过滤，保留第二筛絹上的残留物；(4)用100毫升浓度为200-220克蔗糖/100毫升蒸馏水的饱和蔗糖溶液冲洗第二筛絹上的残留物至离心管中；(5)将所述离心管在台式离心机上1200rpm条件下离心5分钟；(6)吸取所述离心管的所有上清液，上清液采用40微米孔径的第三筛絹过滤，保留所述第三筛絹上的残留物；(7)用100毫升0.45微米滤膜过滤后的过滤海水漂洗第三筛絹上的残留物至培养皿中，实现分离，在显微镜下观察活体细胞。实施例3对停靠在东营港的船舶压载舱沉积物样品进行活体细胞的快速分离，包括如下步骤:(I)米集船舶压载舱沉积物,取5克沉积物放置于培养皿内；(2)用100毫升0.45微米过滤海水冲洗沉积物，采用250微米孔径的第一筛絹过滤，用塑料瓶保存冲洗过滤后的液体；(3)将塑料瓶中保存的液体采用30微米孔径的第二筛絹过滤，保留第二筛絹上的残留物；(4)用100毫升浓度为200-220克蔗糖/100毫升蒸馏水的饱和蔗糖溶液冲洗第二筛絹上的残留物至离心管中；(5)将所述离心管在台式离心机上1200rpm条件下离心3分钟；(6)吸取所述离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)采集船舶压载舱的沉积物，置于培养皿内；(2)用过滤海水冲洗沉积物，并采用第一筛绢过滤，保存冲洗后的液体；(3)将保存的液体采用第二筛绢过滤，保留所述第二筛绢上的残留物；(4)用饱和蔗糖溶液冲洗所述第二筛绢上的残留物至离心管；(5)将所述离心管离心；(6)吸取所述离心管的所有上清液，采用第三筛绢过滤，保留所述第三筛绢上的残留物；(7)用过滤海水漂洗所述第三筛绢上的残留物至培养皿中，实现活体细胞的分离，在显微镜下观察活体细胞。

【技术特征摘要】
1.一种船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)采集船舶压载舱的沉积物，置于培养皿内； (2)用过滤海水冲洗沉积物，并采用第一筛絹过滤，保存冲洗后的液体； (3)将保存的液体采用第二筛絹过滤，保留所述第二筛絹上的残留物； (4)用饱和蔗糖溶液冲洗所述第二筛絹上的残留物至离心管； (5)将所述离心管离心； (6)吸取所述离 心管的所有上清液，采用第三筛絹过滤，保留所述第三筛絹上的残留物； (7)用过滤海水漂洗所述第三筛絹上的残留物至培养皿中，实现活体细胞的分离，在显微镜下观察活体细胞。2.根据权利要求1所述的船舶压载舱沉积物中活体细胞的分离方法，其特征在于:所述第一筛絹的孔径为200~250微米，所述第二筛絹和所述第三筛絹的孔径为30...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄强，
申请(专利权)人：山东恒诚检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37