昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，涉及昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在激活酚氧化酶原激活系统或/和To11信号传递途径系统中的生物活性及其昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在微生物及其相关分子模式检测、制备酚氧化酶原激活系统组装活性物、分离纯化抗菌肽中的应用。本发明专利技术还提供了一种昆虫血淋巴收集方法及其血淋巴储存方法与条件，在此条件下，昆虫血淋巴的稳定性更好，并能更好地发挥其作用。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及生物
，涉及昆虫血淋巴的收集和稳定保存的方法及其应用。具体地说，本专利技术涉及对含有酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)组成成分的昆虫血淋巴的收集方法、针对酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)生物活性稳定的昆虫血淋巴收集方法及其血淋巴储存方法与条件、利用昆虫及其血淋巴的酚氧化酶原激活系统的生物活性以及Toll信号传递系统的生物活性、昆虫血淋巴酚氧化酶原激活系统和Toll信号传递系统的活性成分及其重新组装的生物活性、从昆虫血淋巴获得模式识别受体、级联系统丝氨酸蛋白酶、酚氧化酶及其酶原、抗菌肽等生物活性物质及其生物活性进行微生物检测。本专利技术还涉及昆虫血淋巴的生物活性、血淋巴的收集和稳定保存的方法、体外活性组装物的制备、以及昆虫血淋巴及组装活性物的应用。具体地说，本专利技术涉及对含有酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)组成成分的昆虫及其血淋巴的研究、获得具有稳定生物活性的酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径(系统)的昆虫血淋巴收集方法及其储存方法与条件、针对昆虫及其血淋巴的酚氧化酶原激活系统的生物活性以及Toll信号传递系统的生物活性研究、针对昆虫血淋巴酚氧化酶原激活系统和Toll信号传递系统的活性成分及其体外组装物的生物活性研究、针对从昆虫血淋巴获得模式识别受体/级联系统丝氨酸蛋白酶/酚氧化酶及其酶原/抗菌肽等生物活性物质及其生物活性的研究，以及上述研究在微生物检测领域的应用。
技术介绍
：昆虫血淋巴是其血液和淋巴液的混合物，在昆虫的开放式循环系统中循环，是昆虫代谢的重要场所，也是代谢过程中各种物质储存和交换的场所，在其防御、抗冻、免疫、损伤应答等方面起重要作用。昆虫血淋巴中含有酚氧化酶原激活系统(Pro-phenoloxidase activated system，Pro-PO-AS)以及由酚氧化酶原激活系统相关的Toll信号传递系统。上述两种免疫系统是昆虫体内的重要的先天性识别和防御系统，在其防卫体系中起极为重要的作用，对入侵昆虫体内的微生物具有很强的识别与杀灭作用。酚氧化酶原激活系统是由各种关联性蛋白因子构成的一个复杂的酶级联反应系统，其主要成分除了酚氧化酶原(Pro-Phenoloxidase，Pro-PO)、酚氧化酶(phenoloxidase，PO)以外，同时包括关联性的各种模式识别蛋白、系列丝氨酸蛋白酶(原)及其相应的各种调节剂；Toll信号传递系统是由酚氧化酶原激活系统调控、激活的一个信号传递系统，由各种关联蛋白因子构成了一个复杂的信号传递系统，除含有与酚氧化酶原激活系统共有的各种模式识别蛋白、系列丝氨酸蛋白酶(原)及其相应的各种调节剂外，亦包含抗菌肽及其诱导合成相关蛋白因子。酚氧化酶原激活系统(Pro-PO-AS)通过识别微生物固有成分而被激活，随后产生一系列具有生理活性的物质(包括激活Toll信号传递系统)，并通过多种方式参与宿主防御反应：包括提供调理素、促进血细胞吞噬作用、包囊作用、结节形成以及介导凝集和凝固、产生杀菌物质等。昆虫体内Pro-PO-AS的末端成分之一酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)以无活性酶原(Pro-PO)形式存在，当昆虫受到微生物感染后，通过激活酚氧化酶原激活系统，将Pro-PO转变为有活性的PO。同时，激活的酚氧化酶原激活系统也可激活Toll信号传递系统，诱导机体产生抗菌肽等免疫活性物质。在酚氧化酶原激活系统的上游，昆虫对病原体的识别有别于抗原与抗体的特异性结合，不是针对每一个可能的抗原，而是识别在病原体中普遍存在的高度保守的共有结构。这种识别方式被称为模式识别作用。该作用包含两种不可或缺的成分，病原体相关分子模式和昆虫所具有的模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)或称模式识别蛋白。微生物中普遍存在的高度保守的共有结构被称为病原体相关分子模式(也称微生物相关分子模式或简称相关分子模式)。已报道的病原体相关分子模式包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)、脂磷壁酸(Lipoteichoic acids，LTA)、分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖、细菌DNA中未甲基化的CpG模体、RNA病毒中的双链RNA和真菌的葡聚糖、甘露聚糖等。尽管这些病原体相关分子模式的化学结构极为不同，但它们具有下列共同特征：(1)由病原微生物产生；(2)属于微生物生存所必需的保守分子模式；(3)通常为一大组微生物所共有。目前已发现的昆虫体内模式识别蛋白，根据其与病原体相关分子模式的识别特点可分为：细菌脂多糖模式识别蛋白；肽聚糖模式识别蛋白；脂磷壁酸模式识别蛋白；真菌葡聚糖模式识别蛋白等等，上述模式识别蛋白亦可称为微生物关联性模式识别蛋白，简称关联性模式识别蛋白和关联性识别蛋白。对于昆虫体内酚氧化酶原激活系统、Toll信号传递途径及其相关组成成分的研究始于二十世纪90年代，主要集中于果蝇、烟草天蛾、家蚕、黄粉虫等。在中国专利1149628A中，Ashida提出一种利用家蚕幼虫血淋巴酚氧化酶原激活系统，通过对β-1，3-葡聚糖或肽聚糖含量的测定所建立的简便、快速微生物检测方法。该方法包括把试样滤过一个滤膜，把滤膜上的残留物与含有模式识别受体及酚氧化酶原激活系统相关活性成分的家蚕血液进行反应，根据由此引起的颜色变化检测试样中的微生物。在中国专利1406139A中，Lee bok Luel等人利用黄粉虫模式识别受体及酚氧化酶原激活系统检测真菌特有病原体相关分子模式β-1，3-葡聚糖，并已申报一系列有关黄粉虫模式识别受体和酚氧化酶原激活系统相关活性物质的专利。在中国专利101627052A中，Lee bok Luel等人提供了激活黄粉虫酚氧化酶原的新型蛋白及其编码基因，建立使用该蛋白检测样品中细菌感染的方法并开发相应细菌感染检测试剂盒。血淋巴离体后极不稳定，物理、化学、生物学等各种因素以及血淋巴收集方法、储存条件等均影响并引起血淋巴内包括酚氧化酶原激活系统在内的免疫系统的激活，从而导致黑化等生物反应。此时，酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统及其组分不能被充分利用与应用。同时，如果从昆虫血淋巴中分离纯化制备的酚氧化酶原激活系统以及Toll信号传递系统的活性组分、单体等，也不能充分和更好的利用与应用。目前，国内外未见对鳞翅目(Lepid本文档来自技高网...

【技术保护点】
昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在激活酚氧化酶原激活系统或/和Toll信号传递途径系统中的生物活性。

【技术特征摘要】
1.昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在激活酚氧化酶原激活系统或/和Toll信
号传递途径系统中的生物活性。
2.昆虫、昆虫血淋巴及其组装活性物在微生物及其相关分子模式检测中的应用。
3.昆虫血淋巴在制备酚氧化酶原激活系统组装活性物中的应用。
4.昆虫血淋巴在分离纯化抗菌肽中的应用。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的应用，其特征在于，所述的昆虫血淋巴
含有酚氧化酶原激活系统组分，酚氧化酶原激活系统组分包括针对革兰阳性菌
或革兰阴性菌或真菌的模式识别蛋白一关联性模式识别蛋白、系列关联性丝氨
酸蛋白酶(原)、相应的各种关联性调节剂、酚氧化酶原，酚氧化酶原激活系统
通过识别微生物或相关分子模式，激活下游丝氨酸蛋白酶级联系统，最终导致
酚氧化酶原被激活成酚氧化酶或/和激活Toll信号传递系统，从而诱导产生抗菌
肽。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，制备酚氧化酶原激活系统组装活
性物采用中性盐分级盐析方法、离子交换层析方法、疏水层析方法、凝胶过滤
层析方法制备。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
中性盐分级盐析方法的步骤如下：
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活
性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于
特征要求的温度，优选0℃-10℃；在样品溶液中加入中性盐至饱和度20％，中
性盐完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集沉淀和上清液，沉淀保
存备用，上清液继续加入中性盐至饱和度40％，中性盐完全溶解后放置一段时
间，低温离心后，分别收集沉淀和上清液，沉淀保存备用，上清液继续加入中
性盐至饱和度60％，中性盐完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集
沉淀和上清液，沉淀保存备用，上清液继续加入中性盐至饱和度80％，中性盐
完全溶解后放置一段时间，低温离心后，分别收集沉淀和上清液，沉淀保存备
用，上清液继续加入中性盐至饱和度100％，中性盐完全溶解后放置一段时间，
低温离心后，分别收集沉淀保存备用；
离子交换层析方法的步骤如下：
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系
统活性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并
置于特征要求的温度，优选0℃-10℃；将样品溶液上样于预先用缓冲液平衡好
的离子交换层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白，洗脱方式，采用

\t盐浓度阶段方式，分别用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L
盐溶液进行阶段洗脱；也可以采用盐浓度梯度方式，梯度从0.00mol/L-3mol/L；
离子交换层析分离纯化中：(1)层析介质选择阳离子交换层析添料，选自CM-
离子交换层析添料或SP-离子交换层析添料或S-离子交换层析添料，此时缓冲液
酸碱度选择在pH2-pH7；(2)层析介质选择阴离子交换层析添料，选自Q-离
子交换层析添料或DEAE-离子交换层析添料或QAE-离子交换层析添料，此时缓
冲液酸碱度选择在pH7-pH12；(3)洗脱的盐溶液可以选择规定浓度的缓冲液
或在缓冲液中加中性盐到需要的浓度；(4)中性盐选择(NH4)2SO4Na2SO4或NaCl
或KCl，优选NaCl；
疏水层析方法的步骤如下：
将昆虫血淋巴收集液，按从昆虫血淋巴收集液分离纯化酚氧化酶原激活系统活
性组分技术的特征要求，用酸性溶液或碱性溶液调pH至要求条件范围内并置于
特征要求的温度，优选0℃-10℃；样品溶液中加入中性盐至3mol/L浓度，上样
于预先用缓冲液平衡好的疏水层析，先用缓冲液充分洗涤去除不吸附的杂蛋白，
洗脱方式，采用盐浓度阶段方式，分别采用2.5mol/L、2.0mol/L、1.5mol/L、
1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性盐溶液进
行阶段洗脱；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嵘，赵明沂，张景海，吴春福，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21