一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，是将微载体处理后，以胰蛋白酶将微载体和细胞进行消化，再将细胞逐步进行扩大培养。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其采用反应器和国产的胶原微载体扩大培养细胞的工艺，培养规模从方瓶→（0.25-2L悬浮培养瓶）→（5-7.5L反应器）→（50-120L反应器）→250L反应器→线性放大,从根本上解决了微载体培养细胞规模线性放大的技术工艺，该工艺操作简单，将对现有疫苗工艺进行技术升级的同时，降低了疫苗的生产成本，提高产品产量和质量，在实际生产中具有应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养领域，具体涉及用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法。
技术介绍
目前，我国大多数疫苗仍采用传统的转瓶贴壁培养细胞的工艺生产，如兽用的猪繁殖与呼吸综合征疫苗(蓝耳病疫苗)、猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫疫苗、猪瘟病毒疫苗和羊痘疫苗等，人用的有乙脑疫苗、甲肝疫苗和水痘疫苗等。传统工艺生产的疫苗存在批间差大、批量小,建设厂方面积大,生产过程人力物力投入大,总体来说生产成本高、产品质量不稳定。近几年有些品种的疫苗采用了反应器培养的工艺，如猪瘟疫苗采用了反应器纸片载体培养细胞的工艺，狂犬病疫苗采用了反应器微载体培养工艺，但最大的培养体积只有35L。这些工艺由于解决不了细胞线扩大培养工艺难题而使规模不能线性放大，并且这些工艺中所用的培养载体(如纸片载体和微载体)都是进口的，生产成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种操作简单，成本低廉的用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:，包括以下步骤: 1)微载体处理: 将微载体以含有吐温-80的纯化水浸泡，再以PBS平衡盐溶液清洗后，转入至反应器或悬浮培养瓶中，高压灭菌，冷却静置，以含新生小牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含新生小牛血清的细胞培养液备用； 2)胰蛋白酶消化微载体和细胞: 消化Ig长满细胞的胶原微载体用质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶25-50ml的比例使用胰蛋白酶； 3)细胞扩大培养: 从方瓶一0.25-2L悬浮培养瓶一5-7.5L反应器一50-120L反应器一250L反应器—线性放大。进一步的，上述的，所述步骤I)中的微载体处理，是按照以下步骤进行的: a)所述胶原微载体为GF-240型微载体，将GF-240型微载体用含体积百分含量为万分之一的吐温-80的纯化水浸泡3-12h，期间搅拌一次使之充分浸泡，纯化水的用量为每Ig微载体浸泡需20-1OOml含吐温的纯化水； b)将步骤a)处理的微载体弃纯化水，用无Ca2+、Mg2+的PBS平衡盐溶液洗2次，每次清洗Ig微载体需要20-100mlPBS 平衡盐溶液，所述PBS平衡盐溶液的pH值为7.2±0.1，渗透压在290-320mmol/kg之间； c)将步骤b)处理的微载体弃PBS平衡盐沉溶液，用PBS平衡盐溶液制成2-20g/L的浓度后转移到反应器或悬浮培养瓶中，连同反应器或悬浮培养瓶以121°C高压蒸汽灭菌30min,自然冷却或向其中通空气加速冷却至室温后静置30min以上，所述PBS平衡盐溶液的pH值为7.2±0.I,渗透压在290-320mmol/kg之间； d)将步骤c)处理的微载体弃PBS平衡盐溶液，用含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液洗I遍后再加相同体积的含体积百分含量2%-10%的新生小牛血清NBCS的细胞培养液备用；洗Ig微载体需要20-50ml含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液。所述的细胞培养液是指将市售的MEM、DMEM和DMEM/F12等成品干粉培养基，按说明书配成液体，使用时加入相应比例的NBCS后用于培养动物细胞。进一步的，上述的，所述细胞扩大培养的过程包括以下步骤: A)细胞复苏与扩增培养:按常规方法复苏细胞，在含体积百分含量8%_10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液培养至单层，按常规方法用质量百分比浓度为0.25%-1%胰蛋白酶消化传代细胞至总量达下述B)所需的量； B)悬浮细胞瓶微载体培养细胞:将上述步骤A)的细胞按常规方法消化，按每个载体上10-50个细胞的比例接种到微载体添加量为2-20g/L的悬浮培养瓶中培养，加含体积百分含量8-10%新生小 牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积的40-100%，培养温度为37土1°C，培养前3-12h采用间歇搅拌的方式，其后采用20-50rpm固定转速搅拌，培养12h后加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积100%，从培养时起每隔12_24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量8%-10%NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中培养液的葡萄糖含量> lg/L(因DMEM培养液中的葡萄糖含量为4.5g/L，细胞生长需要消耗培养液中的葡萄糖，取出部分已培养了细胞的培养液，换加没有培养细胞的新鲜培养液可提高培养液中的葡萄糖)，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层；所述间歇搅拌是搅拌3-5min,停止20_60min，再搅拌3_5min的反复搅停过程,其中搅拌转速为20_50rpm ； C)悬浮细胞瓶微载体扩大培养细胞:将上述步骤B)的细胞，以步骤I)中步骤b)的方法以25-38°C预热的PBS平衡盐溶液洗两次，按每克载体用10-50ml质量百分比浓度为0.25%-1%胰蛋白酶酶解消化至胶原载体全部消失和细胞完全分散的状态，加入新生小牛血清NBCS中和l_3min，用备好的原微载体2-8倍的量的微载体进行再培养，培养方法按上述步骤B)进行，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层；其中，中和胰蛋白酶用新生小牛血清NBCS的量是以酶解消化用胰蛋白酶按质量百分比浓度0.25%计算的量的40%-60% ； D)5-7.5L反应器扩大培养细胞:将上述步骤C)处理得到的细胞悬液，同备好的原微载体2-6倍的量的微载体接种5-7.5L反应器中培养，加含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至终培养体积的40-60%，反应器的参数设置为:温度37°C、pH7.1-7.3、溶氧20-80%，转速20_100rpm (转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速为最好)，培养前3-12h采用间歇搅拌的方式，其后采用20-100rpm固定转速搅拌，培养12h后加含体积百分含量8-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液至培养终体积的100%，从培养时起每隔12-24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量8%_10%新生小牛血清NBCS的DMEM培养液，以保证反应器中细胞液的葡萄糖含量> lg/L，至80%以上的微载体上细胞长成致密单层为止; E)50L及以上反应器扩大培养细胞:用上述步骤D)培养得到的细胞，将5-7.5L反应器的细胞按步骤D)逐级扩大培养至50-120L反应器一250 L反应器一线性放大。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供的，其采用反应器和国产的胶原微载体扩大培养细胞的工艺，培养规模从方瓶一(0.25-2L悬浮培养瓶)一(5-7.5L反应器)一(50-120L反应器)一250L反应器一线性放大，从根本上解决了微载体培养细胞规模线性放大的技术工艺，该工艺操作简单，将对现有疫苗工艺进行技术升级的同时，降低了疫苗的生产成本，提高产品产量和质量，在实际生产中具有应用前景。【具体实施方式】 实施例1: 1、材料:1)细胞株，Marc-145细胞，从CCTCC引进； 2)DMEM 培养液，Invitrigen Corporation,货号:02_506本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）微载体处理：将微载体以含有吐温?80的纯化水浸泡，再以PBS平衡盐溶液清洗后，转入至反应器或悬浮培养瓶中，高压灭菌，冷却静置，以含新生小牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含新生小牛血清的细胞培养液备用；2）胰蛋白酶消化微载体和细胞：消化1g长满细胞的胶原微载体用质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶25?50ml的比例使用胰蛋白酶；3）细胞扩大培养：????从方瓶→0.25?2L悬浮培养瓶→5?7.5L反应器→50?120L反应器→250L反应器→线性放大。

【技术特征摘要】
1.一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: .1)微载体处理: 将微载体以含有吐温-80的纯化水浸泡，再以PBS平衡盐溶液清洗后，转入至反应器或悬浮培养瓶中，高压灭菌，冷却静置，以含新生小牛血清的细胞培养液清洗后加入相同体积的含新生小牛血清的细胞培养液备用； .2)胰蛋白酶消化微载体和细胞: 消化Ig长满细胞的胶原微载体用质量百分比浓度为0.25%的胰蛋白酶25-50ml的比例使用胰蛋白酶； . 3)细胞扩大培养: 从方瓶一0.25-2L悬浮培养瓶一5-7.5L反应器一50-120L反应器一250L反应器—线性放大。2.根据权利要求1所述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其特征在于，所述步骤I)中的微载体处理，是按照以下步骤进行的: a)所述胶原微载体为GF-240型微载体，将GF-240型微载体用含体积百分含量为万分之一的吐温-80的纯化水浸泡3-12h，期间搅拌一次使之充分浸泡，纯化水的用量为每Ig微载体浸泡需20-1OOml含吐温的纯化水； b)将步骤a)处理的微载体弃纯化水，用PBS平衡盐溶液洗2次，每次清洗Ig微载体需要20-100mlPBS平衡盐溶液，所述PBS平衡盐溶液的pH值为7.2±0.1,渗透压在.290-320mmol/kg 之间； c)将步骤b)处理的微载体弃PBS平衡盐沉溶液，用PBS平衡盐溶液制成2-20g/L的浓度后转移到反应器或悬浮培养瓶中，连同反应器或悬浮培养瓶以121°C高压蒸汽灭菌30min,自然冷却或向其中通空气加速冷却至室温后静置30min以上，所述PBS平衡盐溶液的PH值为7.2±0.1，渗透压在290-320mmol/kg之间； d)将步骤c)处理的微载体弃PBS平衡盐溶液，用含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液洗I遍后再加相同体积的含体积百分含量2%-10%的新生小牛血清NBCS的细胞培养液备用；洗Ig微载体需要20-50ml含体积百分含量10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液。3.根据权利要求2所述的一种用胶原微载体在反应器中扩大培养动物细胞的方法，其特征在于，所述细胞扩大培养的过程包括以下步骤: A)细胞复苏与扩增培养:按常规方法复苏细胞，在含体积百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的细胞培养液培养至单层，按常规方法用质量百分比浓度为0.25%-1%胰蛋白酶消化传代细胞至总量达下述B)所需的量； B)悬浮细胞瓶微载体培养细胞:将上述步骤A)的细胞按常规方法消化，按每个载体上10-50个细胞的比例接种...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯玉萍，乔自林，令世鑫，李明生，冯若飞，王家敏，马忠仁，
申请(专利权)人：乔自林，马忠仁，令世鑫，冯玉萍，冯若飞，李明生，王家敏，
类型：发明
国别省市：