本发明专利技术首次运用基因工程手段提供了一种来源于真菌的新的免疫调节蛋白FIP-ppl。本发明专利技术还提供并合成了编码上述蛋白的基因，所述蛋白FIP-ppl具有免疫调节和抗肿瘤作用。经实验证实，所述蛋白对脾淋巴细胞具有催分裂作用，并可增加细胞介素2的合成；本发明专利技术还证实了所述蛋白对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC823均具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。本发明专利技术的蛋白FIP-ppl与已发现的多数真菌免疫调节蛋白同源性低，是一种新型的免疫调节和抗肿瘤生物制剂。
【技术实现步骤摘要】
真菌免疫调节蛋白FIP-ppl及其基因
:本专利技术涉及基因工程领域，具体地，涉及一种具有免疫调节和抗肿瘤活性的真菌免疫调节蛋白FIP-PPl及其基因。
技术介绍
:真菌免疫调节蛋白(Fungalimmunomodulatory proteins,以下简称为 FIPs)是近年来从一些高等担子菌(食用菌类)子实体中提取的，与植物凝集素和免疫球蛋白结构和功能相似的一类小分子蛋白质。FIPs具有调节免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇和抑制机体自体免疫等多种重要的生理功能。FIPs具有独特的生理功能，而且具有极强的稳定性和食用安全性，可以调节免疫力，抑制肿瘤发生，治疗过敏等。因此，FIPs即可以用作增强机体健康的保健品功能成分，还可以开发成预防和治疗疾病的天然药物。目前世界上报道的FIPs种类较少，并且多数是从蘑菇中得到的。虽然真菌的种类繁多，但是由于食用菌含有大量多糖和其它杂质成分，且FIPs的相对含量较低，小肽制备、分析相对较难，导致FIPs蛋白的提取工艺复杂、周期长、成本高、得率低，因而严重影响和限制了新的FIPs的发现及其大量制备。而且，临床与医药应用均具有一定的剂量和纯度要求，若开发和应用此 类药品，必须获得相当数量的蛋白质纯品。所以，真正能应用的FIPs较少。因此，通过基因工程方法从已完成基因组测序的真菌中获得可开发利用的FIPs蛋白，既能丰富FIPs家族的种类，更能为人类健康的保健和治疗提供新的免疫调节剂。
技术实现思路
:本专利技术的目的是通过生物信息学方法筛选到一种来源于真菌的免疫调节蛋白，并将其应用于免疫调节和抗肿瘤药物的制备中。本专利技术的目的还包括提供上述真菌免疫调节蛋白的基因、重组表达载体、重组菌株。本专利技术的另一目的是提供上述真菌免疫调节蛋白的制备方法。本专利技术人通过生物信息学方法筛选到一种来源于真菌Postia placentaMad-698-R的免疫调节蛋白FIP-ppl，发现其适合于在保健品和医药中使用。所述真菌免疫调节蛋白FIP-ppl，全长125个氨基酸，理论分子量为14.738kDa，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。FIP-ppl蛋白是一种新型的真菌免疫调节蛋白。本专利技术人通过将其cDNA序列推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现:FIP_ppl蛋白与小孢灵芝、赤灵芝、紫灵芝和金针菇真菌免疫调节蛋白GM1、FIP-gja、LZ-8和FlP-fve的序列同源性仅分别为58%、56%、54%和52%。说明FIP-ppl是一种新的真菌免疫调节蛋白。本专利技术还提供并合成了编码上述真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的基因:通过一对引物 FIP-P-GST-F (EcoRI):5’-GAA TTC ATT ACT TAT GTT CTT CAG G-3’ 和FIP-P-22b-R’(XhoI):5’-CTC GAG TTA CTG GGA CTG GG-3’，用基因合成的方法克隆了这一真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的基因，DNA全序列分析结果表明，fip-ppl全长384bp，其cDNA序列如SEQ ID N0.2所示。本专利技术还提供了包含蛋白FIP-ppl基因的重组表达载体。方法是将本专利技术的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。优选的表述载体是PGEX-4T-1。 作为本专利技术的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是PGEX-4T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠表达载体pGEX-fip-pplο将上述重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌。所述宿主细胞优选为大肠杆菌Rosetta,得到重组菌株 ROS/GST-FIP-ppl。本专利技术还提供了包含真菌免疫调节蛋白FIP-ppl基因的重组菌株，优选为重组菌株 ROS/GST-FIP-pplο本专利技术还提供了制备真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的方法，包括以下步骤:I)将含FIP-ppl基因的重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组真菌免疫调节蛋白FIP-ppl的表达；以及3)回收并纯化所表达的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl。经免疫调节、肿瘤抑制和凋亡实验证实:FIP-ppl蛋白对脾淋巴细胞具有催分裂作用，增加细胞介素2的合成，对二种肿瘤细胞包括肝癌细胞H印G2和胃癌细胞MGC823均具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，可应用于保健品和医药等工业(详见实施例3~6)。本专利技术优点和有益效果:1、可以提供相当数量的免疫调节蛋白质FIP-ppl纯品，完全能满足临床与医药应用需求。FIP-ppl在该大肠杆菌表达系统中实现高效表达，表达量为36mg/L(实施例2);经柱纯化后，蛋白质的含量达到电泳纯(图1A)，经质谱鉴定表达正确(图1B)。而目前通常从几千克食用菌中只能提取毫克级蛋白。2、FIP-ppl可作为免疫调节剂，提高机体免疫力。FIP-ppl可以高效激活淋巴系统，提高免疫力(实施例3)，还可以激活T淋巴细胞增殖，诱导ThI特异性的细胞介素合成(实施例4)。3、FIP-ppl具有抗肿瘤活性，具有治疗应用潜力。对胃癌细胞和肝癌细胞具有毒性作用，特别是对于胃癌细胞MGC823具有更高毒性和特异性(实施例5)，其作用机理是通过诱导肿瘤细胞凋亡对细胞产生毒性(实施例6)。4、首次运用基因工程手段提供了一个新的真菌来源的免疫调节蛋白。由于运用基因工程手段来产业化生产真菌免疫调节蛋白FIP-ppl产品还未见报道。本专利技术首次提供了一个新的真菌来源的免疫调节蛋白FIP-ppl。而且，根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产真菌免疫调节蛋白FIP-ppl。【附图说明】:图1~图5是对本专利技术纯化制备的真菌免疫调节蛋白FIP-ppl进行的分析和功能实验，其中:图1是SDS-PAGE分析和质谱鉴定:其中，图1A为SDS-PAGE分析，条带I为分子量标品,条带2为纯化的FIP-ppl蛋白；图1B为质谱鉴定，底端划线部分为质谱鉴定序列。图2是蛋白FIP-ppl促进鼠脾淋巴细胞增殖结果。图3是蛋白FIP-ppl促进细胞介素2合成结果。图4是蛋白FIP-ppl肿瘤抑制实验结果。图5是蛋白FIP-ppl诱导肿瘤细胞凋亡结果。【具体实施方式】以下实施例仅用于举例说明本专利技术的方法，并不限制本专利技术的范围。试验材料1、细胞株:人肝癌细胞H印G2、人胃癌细胞MGC823、4_6周无致敏环境下生长的BalB/C 小鼠。 2、试剂盒、酶类、生化试剂和仪器:试剂盒:Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，小鼠白介素2定量ELISA检测试剂盒购于北京鼎国生物公司；PCR引物合成和基因测序均由上海生工生物公司完成；酶类:内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司；仪器:离心机、振荡摇床、显微镜、酶标仪、流式细胞仪；生化试剂:氨苄青霉素、青霉素(钠盐)、硫酸链霉素、溴酚兰、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、噻唑兰(MTT)、小牛血清(BSA)、植物凝集素(PHA)，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品。3、培养基RPMl 1640 培养基(ρ本文档来自技高网...
【技术保护点】
真菌免疫调节蛋白FIP‑ppl，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.真菌免疫调节蛋白FIP-PPl，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示。2.编码权利要求1所述蛋白FIP-ppl的基因，其碱基序列如SEQID N0.2所示。3.含权利要求2所述基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，是权利要求2所述的基因插入表达载体pGEX-4T-l上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，所得到的重组表达载体pGEX-fip-pplο5.权利要求3或4所述的重组表达载体转化的宿主细胞。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，为...
【专利技术属性】
技术研发人员：李淑英，唐选明，丁洋，聂莹，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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