一种从光帽鳞伞中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种从光帽鳞伞（Pholiota nameko）中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法。本发明专利技术的抗肿瘤蛋白是将光帽鳞伞（Pholiota nameko）子实体磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换和凝胶层析而获得。该蛋白是分子量为17KDa的单体蛋白，N-端氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示序列Ala Gly Arg Thr Phe Ile Gly Tyr Asn Gly；对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用。本发明专利技术中光帽鳞伞（Pholiota nameko）抗肿瘤蛋白为天然提取物，对人类和环境均无害；制备方法简单，成本较低，适于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
,具体涉及一种从光帽鳞伞(Pholiota nameko,俗名:滑子菇)中提取的抗肿瘤蛋白及其制备方法。
技术介绍
近年来，蘑菇作为中药或功能性食品，在食品和医药行业备注关注。从蘑菇中分离获得的许多活性成分，包括小分子、多糖、蛋白、多糖-蛋白复合物等，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗微生物和免疫调节的作用。其中，有关多糖的研究最为广泛，然而，蘑菇中含量丰富的生物活性蛋白，包括凝集素，真菌免疫调节蛋白，核糖体失活蛋白，抗微生物蛋白，核糖核酸酶和漆酶等，在食品和医药领域的应用上展现出巨大的潜能。光帽鳞伞(Pholiota nameko)属真菌门，担子菌纲,伞菌目，球盖燕科,鳞伞属。它是一种冬、春季发生的菌盖粘滑的木腐菌，因其菌盖表面有粘液而又被称为滑子菇，是世界上五大宗人工栽培的优质食用菌之一。光帽鳞伞(Pholiota nameko)具有滑、鲜、嫩、脆的特点，富含有益于人体健康的蛋白质、糖类、矿物元素(I丐、磷、铁)、维生素(维生素VB2、维生素C、烟酸)以及人体所必须的其他各种氨基酸等营养保健物质，是一种低热量的保健食品。据分析，每IOOg干菇含粗蛋白33.76g、纯蛋白15.13g、脂肪4.05g、总糖38.89g、纤维素14.23g、灰分8.99g。除食用价值外，也具有一定的药用价值。其子实体含丰富的多糖，能够提高机体的免疫力。目前，除了对光帽鳞伞(Pholiota nameko)生长特性，栽培技术的研究外，对其生物活性的研究主要集中在多糖上，而对其中含量丰富的生物活性蛋白研究尚浅。周蕊等(南京林业大学硕士学位论文2007 )从Pholiota nameko菌丝发酵液中分离纯化得到分子量为 55KDa的漆酶。Yasuko Kawamura-Konishi等(Biosc1.Biotechnol.Biochem., 71 (7): 1752-1760)从 Pholiota nameko 子实体中分离纯化得到酪氨酸蛋白酶，分子量约为 42KDa。Gu1-Ping Guan 等(Journal of Bioscience andBioengineering2011, 111 (6):641-645)从 Pholiota nameko 子实体中分离纯化得到丝氨酸蛋白酶，分子量约为19KDa。漆酶可用于降解木质素，酪氨酸蛋白酶主要用于环境治理包括含有酚类的废水和污染的土壤的处理。而本专利技术首次从Pholiota nameko中分离纯化得到一种新的具有抗肿瘤活性的蛋白。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供光帽鳞伞(Pholiota nameko)中的一种抗肿瘤蛋白及其制备方法，该蛋白对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用。本专利技术提供的从光帽鳞伞(Pholiota nameko)中提取的抗肿瘤蛋白，分子量为17KDa, N-端氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所不序列 Ala Gly Arg Thr Phe He Gly Tyr AsnGly，该抗肿瘤蛋白简称为 PNAP (Pholiota nameko Ant1-tumor protein)。本专利技术涉及的光帽鳞伞(Pholiota nameko)中的抗肿瘤蛋白是按照如下方法制备的:(I)将光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体研磨成粉,溶解于0.2 0.5M的NaCl溶液，2 6°C浸提8 16小时，5000"8000rpm离心2(T40min，收集上清液，即光帽鳞伞Pholiotanameko子实体粗提液；(2)向步骤(I)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为70 100%，2 6°C放置8 16小时，1000(T20000rpm离心l(T40min，收集沉淀，即光帽鱗伞Pholiota nameko蛋白粗提物；(3)将步骤(2)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗提物用20 50mM、ρΗ6.(T9.0的PBS缓冲液溶解，然后在2 6°C、1飞倍重量的蒸馏水中透析8 16小时，反复3飞次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉；(4)将步骤(3)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko )蛋白粗粉溶解于25 50mMMES、ρΗ5.0 6.0的MES A缓冲液中，上样离子交换层析柱，用25 50mM MES、0.5 IM NaCl、ρΗ5.(Γ6.0的MES B缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰；(5)将洗脱峰上样分子筛，用 25 50mM MES、20(T500mM NaCl, ρΗ5.0 6.0 的 MES C缓冲液洗脱，获得抗肿瘤蛋白。本专利技术中光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白对人乳腺癌细胞株MCF7的生长具有明显的抑制作用，JC-1染色分析线粒体膜电位证明该蛋白能够诱导肿瘤细胞凋亡。本专利技术具有的优点和有益效果: (I)本专利技术中光帽鳞伞(Pholiota nameko)抗肿瘤蛋白为天然提取物,具有良好的安全性；(2)本专利技术中抗肿瘤蛋白为单一蛋白，为获得该蛋白的氨基酸及其编码基因提供了基础；(3)本专利技术中抗肿瘤蛋白具有良好的抗肿瘤效果；(4)本专利技术中抗肿瘤蛋白制备简单，成本低，适于大规模生产。附图说明图1是本专利技术Pholiota nameko抗肿瘤蛋白的离子交换层析图。图2是本专利技术Pholiota nameko抗肿瘤蛋白的凝胶色谱层析图。图3是本专利技术Pholiota nameko抗肿瘤蛋白的SDS-PAGE图。图4是本专利技术Pholiota nameko抗肿瘤蛋白对MCF7细胞生长的抑制作用。图5是本专利技术Pholiota nameko抗肿瘤蛋白对肿瘤细胞凋亡的诱导作用(A.未加抗肿瘤蛋白的MCF7细胞；B.511|1抗肿瘤蛋白处理的1 ^7细胞；C.10 μ M抗肿瘤蛋白处理的MCF7细胞；D.15 4] 抗肿瘤蛋白处理的]\077细胞)。具体实施例下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1光帽鳞伞(Pholiota nameko)中抗肿瘤蛋白的制备(I)将光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体研磨成粉,溶解于0.5M的NaCl溶液，4°C浸提12小时，5000rpm离心20min,收集上清液，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液；(2)向步骤(1)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)子实体粗提液中加入硫酸铵至饱和度为75%，4°C放置12小时，18000rpm离心40min，收集沉淀，即光帽鳞伞(Pholiotanameko )蛋白粗提物；(3)将步骤(2)中的光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗提物用50mM、pH8.0的PBS缓冲液溶解，然后在4°C、5倍重量的蒸馏水中透析12小时，反复3次，透析后进行冷冻干燥，即光帽鳞伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉；(4)将步骤(3)中的光帽鱗伞(Pholiota nameko)蛋白粗粉溶解于50mM MES、pH6.0的MES A缓冲液中，上样离子交换层析柱，用50mM MES,0.8M NaCl、pH6.0的MES B缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰；(5)将洗脱峰上样分子筛，用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光帽鳞伞（Pholiota nameko）中提取的抗肿瘤蛋白PNAP，所述的抗肿瘤蛋白PNAP来自光帽鳞伞（Pholiota nameko），分子量为17KDa，N‑端氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示序列Ala Gly Arg Thr Phe Ile Gly Tyr Asn Gly。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘方，张业尼，刘赵昆，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12