一株内生真菌及其生物转化甘草酸为甘草次苷的方法技术

本发明专利技术涉及一株内生真菌及其生物转化甘草酸为甘草次苷的方法，该菌命名为DX-SES3，鉴定为Microsphaeropsisarundinis，并已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2014177。该菌能在甘草酸的诱导下产生β-葡萄糖醛酸苷酶，进而催化甘草酸生产GAMG；所产生的GAMG富聚在菌体的表面，75%的乙醇冲洗菌体，减压浓缩喷雾干燥后获得GAMG粗制品，HPLC检测纯度为89.4%。本发明专利技术采用生物转化方法，不仅甘草酸的转化率高，绿色环保无污染，而且GAMG富聚于菌体表面，产物分离纯化简单易行。

【技术实现步骤摘要】

    本专利技术涉及生物转化
及产物分离工艺，主要涉及一株能将甘草酸单一、定向的转化为甘草次苷（GAMG）的东乡野生稻内生真菌及GAMG分离纯化制备方法。 技术背景    甘草酸（GL）是甘草中的主要活性成分之一，是甘草中含量最高的三萜类化合物，结构如图1所示，是由五环三萜皂苷通过糖苷键连接两个葡萄糖醛酸构成的。现代药理学研究表明，甘草酸具有抗炎症、抗病毒、抗过敏、抗肿瘤等药理作用，还是一种高甜度、低热量的新型甜味剂，具有一定的应用价值。     甘草酸经β-葡萄糖醛酸苷酶水解去除其末端的一个葡萄糖醛酸基就生成GAMG（如图1），是甘草酸的一个重要的衍生物。甘草次苷又叫单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG），其应用价值远大于甘草酸。首先，在食品中应用方面，GAMC的甜度约为蔗糖甜度的941倍，是甘草酸甜度的5倍多，GAMG不仅有较强的持续性甜味，是一种高甜度、低热量的新型甜味剂，而且可有效减少因高热量甜味剂的摄入引发的肥胖、糖尿病、高血脂症、龋齿等疾病；其次，在药物方面的应用，GAMG和甘草酸具有相类似的药理作用，但甘草次苷中等极性，在体内溶解度较好的和较易跨膜转运，比甘草酸生物利用度更好，其生物利用度优于甘草酸类药物及甘草次酸类药物，具有显著的新药物开发价值，如在对TPA诱导的Epstein-Barr病毒早期抗原形成的抑制率显示，GAMG的抑制率达到了100%，而甘草酸的抑制率只有84.4%，许多研究表明了抗肿瘤、抗病毒、抗炎症等方面有良好的功效，并证实其多种的药理活性不亚于甘草酸，最重要的一点是甘草次苷比甘草酸更安全，甘草次苷的LD50为5000 mg/kg，而甘草酸的LD50 为805 mg/kg；最后，GAMG在化妆品中也有重要的应用，GAMG可使油性香水或荷尔蒙增溶，可用于透明化妆品中，不会产生泡沫，也可用于面霜或乳液中，配制成稳定的水包油乳液等。因此生产和开发GAMG具有很重要的应用价值和现实意义。 GAMG的获取途径比较少，主要途径有以下几条：一是化学合成法合成GAMG，Brieskorn等和Mizutani等首次合成了GAMG，但合成路线长，收率很低。二是传统的化学水解法，通过水解去掉甘草酸的葡萄糖醛酸基生成甘草次苷，但此法对甘草酸的两个糖苷键选择性低，不能定向水解生成甘草次苷，副产物多，得率较低，同时存在高耗能，高污染的缺点。三是利用微生物所产生的β-D-葡萄糖醛酸酶水解甘草酸而制备得到的，这也是目前GAMG的主要获得途径，而其β-D-葡萄糖醛酸酶用量过大，来源不方便也不经济，并且产物较难分离纯化。此外，根据欧盟和美国的立法，通过化学方法获得的产品不是天然物质，应用于食品领域受到限制，而利用酶法或微生物法（即生物转化法）得到的物质，被认为是天然物质。生物转化是指利用微生物、动植物和培养体系或其产生的酶对外源化合物进行结构修饰的生物化学反应过程，其本质是利用生物体系产生的酶对外源化合物进行酶催化反应。利用生物转化甘草酸生成GAMG已有报道过，其不仅具有专一性高、效率高的优点，而且方法简单、便于分离，是今后获得GAMG的理想途径。 本专利技术人从国家二级保护植物禾本科植物东乡野生稻健康的组织中分离并筛选到能将甘草酸单一定向的转化为GAMG的内生真菌——菌株DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)。该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2014177。该菌能在甘草酸的诱导下，能将甘草酸定向转化为GAMG，且转化率较高，特别指出的是，合成的GAMG富积在菌球的表面，极大的利于后续GAMG的分离纯化工作，这为利用该菌株生物转化生成制备GAMG提供了新的研究思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株具有定向转化甘草酸为GAMG的东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)。本专利技术不仅克服了现有工艺技术中催化定向性差，污染环境，高耗能，转化率低等不足的缺点，而且还避免了GAMG分离纯化的复杂工序。 本专利技术中转化甘草酸为GAMG的内生真菌菌株，命名为DX-SES3，分类为小球壳孢属菌Microsphaeropsi sarundinis，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年5月3日，保藏号为CCTCC M 2014177。 本专利技术所述的东乡内生真菌菌株DX-SES3的形态特征为：在PDA上28℃培养5-7 d，5天菌落直径为20 mm，7天菌落直径为30-35 mm，7天菌落直径无变化；质地絮状，中部突起，表面灰白色，中间色深，边缘色浅，老后颜色加深，无渗透液，无可溶性色素，菌落反面为黑色；菌丝细长弯曲，呈黑色或灰黑色；分身孢子较少，为蛹虫状（如图2）。 本专利技术所述的东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis) 基因登录号为KC871028。 本专利技术所述的东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成甘草次苷包括以下步骤： 步骤一、将东乡野生稻内生真菌DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)，接种到PDA斜面培养基中培养活化72～84小时，并制作孢子悬浮液，然后接种至种子培养基中，28±1℃，150～300 r/min，摇床培养至对数生长期。 步骤二、按照质量分数10%～30％的接种量把上述对数生长期的种子液接种至含甘草酸的转化培养基中，转化产生甘草次苷至含量基本恒定。 步骤三、冲洗菌球表面的GAMG，并分离纯化GAMG。 优选的是，所述的DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成GAMG，步骤一中种子培养基的组成为：每升培养基中含葡萄糖10～40g，甘草酸（或甘草酸铵盐）0.1～1 g，KH2PO41.0～3.0 g， NH4NO3 2.0～5.0 g， NaCl 0.3～0.8 g，酵母粉0.05～0.3 g， MgSO40.1～0.5 g， CaCl20.01～0.5 g， FeSO4 0.014 g ，ZnSO4·7H2O 2.9 mg，MnCl2·4H2O 2.0 mg， CuSO4·5H2O 0.25 mg，CoCl2·6H2O 0.24 mg，Na2MoO4·2H2O 0.24 mg， H3BO3 0.03 mg， 其余为纯水，调pH为5.0～7.0。 优选的是，所述的DX-SES3 (Microsphaeropsi sarundinis)转化甘草酸定向生成GAMG，在步骤二中转化培养基组成为：每升培养基中含甘草酸（或甘草酸铵盐） 2～30 g， KH2PO4 1.0～3.0 g， NH4NO3 2.0～4.0 g， NaCl 0.3～0.8 g，酵母粉0.05～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株转化甘草酸为GAMG的内生真菌菌株，其特征在于：命名为DX‑SES3，分类为小球壳孢属菌Microsphaeropsi sarundinis，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年5月3日，保藏号为CCTCC M 2014177。

【技术特征摘要】
1.一株转化甘草酸为GAMG的内生真菌菌株，其特征在于：命名为DX-SES3，分类为小球壳孢属菌Microsphaeropsi sarundinis，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2014年5月3日，保藏号为CCTCC M 2014177。
2.一种内生真菌生物转化甘草酸为GAMG的方法，包括如下步骤：
1）内生真菌的活化及种子液的制备；
2）GAMG生物转化：将步骤1）的种子液按质量分数20-40%的接种量加入到转化培养基中，进行GAMG的生物转化；
3）GAMG的分离制备：生物转化后的GAMG富聚于内生真菌菌球的表面，布氏漏斗抽滤或六层纱布过滤，收集菌体，用体积比为20%～100%的乙醇溶液冲洗菌体3-5次，收集乙醇溶液，后减压浓缩，再喷雾干燥，获得纯度较大的GAMG成品，并用HPLC、LC-MS进行检测。
3.如权利要求2所述的内生真菌生物转化甘草酸为GAMG的方法，其特征在于所述的内生真菌DX-SES3（Microsphaeropsis arundinis）在PDA培养基中，28±1℃培养7 d，菌落的直径为28～30 mm质地绒状，中部凸起，同心轮纹状，菌落灰色，边缘色浅，无渗出液；菌落反面中央为黑褐色，其外围为棕褐色，再外围为淡黄色，培养时间菌落颜色变深为深灰色至褐色，但菌落不不变大；在CA培养基中，28±1℃培养6 d菌落直径为37～39 mm，菌落起初白色后逐渐变成灰白色且，中央凸起且现絮状，同心轮纹状，边缘整齐，背面白色，在光学显微镜下，菌丝有隔，可见蛹虫状的孢子囊结构。
4.如权利要求2所述的内生真菌生物转化甘草酸为GAMG的方法，其特征在于所述的内生真菌DX-SES3（Microsphaeropsis arundinis）菌株基因登录号为KC871028。
5.如权利要求2所述的内生真菌生物转化甘草酸为GAMG的方法，其特征在于所述的种子液培养制备为：将内生真菌DX-SES3（Microsphaeropsis arundinis...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志斌，高波良，朱笃，李平，颜日明，汪涯，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西;36