本发明专利技术公开了一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术采用定点突变方法将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶的第32位天冬氨酸(Asp)分别突变为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)或谷氨酰胺(Gln)，所得突变体相比于野生CGT酶，环化活力明显提高，更适合环糊精的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
本专利技术涉及一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α -1, 4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β_和Y-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构，具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精的环化活力较低，使得环糊精的工业生产成本较高。本专利技术中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) STBOl的β-CGT酶总的环化活 力约为302U/mg，因此，进一步提高该酶的环化活力，将更加有利于环糊精的工业化生产。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的CGT酶的第32位的天冬酰胺(Asn)分别突变为精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)或谷氨酰胺(Gln)。所得6种突变体分别命名为:N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q。编码所述CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) STBOl。所述 CGT 酶的氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所不。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体N32R、N32K、N32H、N32E和N32D的方法。根据B.circulans STB01CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入Arg32、Lys32、His32、Glu32、Asp32和Gln32密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q突变体的基因，并在枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。所述方法包括以下步骤:(I)利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突变，所用引物分别是:引入Asn32Arg突变的引物:正向引物:5’ -GCAATCCCGCCAGAAATCCGACC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGTCGGATTTCTGGCGGGATTGC-3 ’，下划线为突变碱基；引入Asn32Lys突变的引物:正向引物:5’ -GCAATCCCGCCAAAAATCCGACC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGTCGGATTTTTGGCGGGATTGC-3，，下划线为突变碱基；引入Asn32His突变的引物:正向引物:5’ -GCAATCCCGCCCATAATCCGACC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGTCGGATTATGGGCGGGATTGC-3 ’，下划线为突变碱基；引入Asn32Glu突变的引物:正向引物:5’ -GCAATCCCGCCGAAAATCCGACC-3 ’，下划线为突变碱基，[0021 ]反向引物:5 ’ -GGTCGGATTTTCGGCGGGATTGC-3 ’，下划线为突变碱基；引入Asn32Asp突变的引物:正向引物:5’ -GCAATCCCGCCGATAATCCGACC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGTCGGATTATCGGCGGGATTGC-3 ’，下划线为突变碱基。引入Asn32Gln突变的引物:正向引物:5’ -GCAATCCCGCCCAAAATCCGACC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGTCGGATTTTGGGCGGGATTGC-3 ’，下划线为突变碱基。PCR 反应体系均为:5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各2.5πιΜ)4μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L,模板 DNAl μ L，PrimeSTAR HSDNA Polymerase (2.5U/ μ L) 0.5 μ L,加入双蒸水 32.5 μ L。PCR反应扩增条件均为:PCR扩增条件均为:98°C预变性4min ;随后98 °C 10s，55°C 15s，72°C 8min 进行 35 个循环；最后 72°C保温 lOmin。将PCR产物经过DpnI消化2h后,转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将含编码CGT酶突变体的基因的表达载体转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞中。上述各培养基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。(2)突变体的表达与纯化挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h,以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水PhenylHP柱和强阴离子交换Q-HP柱相结合的方法，分别纯化得到突变体N32R、N32K、N32H、N32E和N32D酶制品。各培养基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。本专利技术的有益效果:构建了 6个有意义的突变体N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q，均实现了重组CGT酶环化活力的提高，比野生型CGT酶更利于环糊精的工业化生产。【附图说明】图1野生型CGT酶及其突变体在pH6.5、50°C下作用于10% (湿基，w/v)麦芽糊精生产环糊精情况；A，野生CGT酶；B，突变体N32R ；C,突变体N32K ；D,突变体N32H ；E,突变体N32E ；F,突变体N32D ；G,突变体N32Q ； , α-环糊精；籲，β -环糊精；▲，Y -环糊精。【具体实施方式】实施例1突变位点的确定钙离子结合位点广泛存在于α -淀粉酶家族中，作为α -淀粉酶家族(家族13)的一员，CGT酶也具有相似的钙离子结合位点。来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STBOl的CGT酶第32位氨基酸残基天冬酰胺(Asn)位于钙离子结合位点Ca I处，该位点处氨基酸残基空间结构复杂:距离Asn32 6A以内的极性亲水氨基酸残基有Asp27、Asn29、Asn33、Gly51、Asp53、Tyrll2、Glyll3、Aspll5 ;距离Asn32 6人以内的非极性疏水氨基酸残基有Pro30、34、110、Al a31、111。这种多样化的复杂构象暗示了该位点引入较长侧链或电负性较强的极性亲水氨基酸残基可能会对酶的活性产生影响。实施例2 突变体 N32R、N32K、N32H、N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第32位的天冬酰胺分别突变为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺。
【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第32位的天冬酰胺分别突变为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺。2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。4.一种获得权利要求1所述突变体的方法，根据SEQ ID N0.1所示的基因序列，分别设计并合成定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述定点突变引物分别是: 弓丨入Asn32Arg突变的引物:正向引物:5 ’ -GCAATCCCGCCAGAAATCCGACC-3，，反向引物:5’ -GGTCGGATTTCTGGCGGGATTGC-3’ ； 弓丨入Asn32Lys突 变的引物:正向引物:5 ’ -GCAATCCCGCCAAAAATCCGACC-3，，反向引物:5’ -GGTCGGATTTTTGGCGGGATTGC-3’ ； 弓丨入Asn32Hi s突变的引物:正向引物:5 ’ -GCAATCCCGCCCATAATCCGACC-3，，反向引物:5’ -GGTCGGATTATGGGCGGGATTGC-3’ ； 弓丨入Asn32Glu突变的引物:正向引物:5 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾正彪，李兆丰，黄敏，李才明，洪雁，程力，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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