一种具有环状结构的抗菌肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一类具有环状结构的抗菌肽，抗菌肽的氨基酸序列为序列表SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的氨基酸序列所示，具有分子内环状结构。本发明专利技术抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌活性，其氨基酸序列短、结构简单、合成方便、抗菌活性高，可用于金黄色葡萄球菌引起的疾病的预防与治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗菌剂领域，具体涉及一种具有环状结构的抗菌肽及其制备方法和应 用。
技术介绍
长期大量使用抗生素导致致病菌产生顽强的耐药性，对患者的生命健康造成严重 的危害。近30年新型抗生素的研究进展缓慢，解决病菌耐药性这一问题已经迫在眉睫。抗菌 肽(Antimicrobial Peptides，AMP)是一种具有强抗菌作用的阳离子多肽，是生物先天免疫 系统的重要组成。抗菌肽在自然界分布广泛，在微生物、动植物体内都有发现。抗菌肽大多 具有广谱抗细菌活性，并且对真菌、病毒及癌细胞也有杀伤作用。天然存在的抗菌肽一般是 由12-50个氨基酸组成，同时具有两个明显的特征:带有两个以上的相邻的正电荷或具有两 亲性空间结构。天然抗菌肽N末端有较强的形成两亲a螺旋的趋势，多富含碱性氨基酸(赖氨 酸，精氨酸），呈强碱性，带电荷氨基酸均在螺旋一侧分布;C端有形成疏水(螺旋）的倾向，C 端大部分酰胺化且C端中性疏水。因此我们可以知道天然抗菌肽所带正电荷是形成抗菌作 用的必要条件。抗菌肽是一种很有潜力的新抗菌药物来源。人们一方面在继续寻找新的阳 离子抗菌肽，另一方面对已知的天然抗菌肽进行改造以求获得高效安全的抗菌药物。尽管 如此，阳离子抗菌肽仍存在着许多尚待解决的问题:抗菌肽一级结构中由于含有多个碱性 氨基酸(如赖氨酸、精氨酸)而容易被胰蛋白酶水解，从而限制了抗菌肽作为抗感染药物的 体内使用。同时有些阳离子抗菌肽可对哺乳动物细胞产生巨大的毒性作用。因此，开发安 全、稳定、低细胞毒性的抗菌肽具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新型抗菌肽，该抗菌肽对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)具有抗菌活性。 本专利技术提供了一种多肽，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 1或SEQ ID No.2的氨 基酸序列所示，所述多肽通过其氨基酸序列中的2个半胱氨酸残基成分子内二硫键，形成环 状。具体的，所述多肽通过其氨基酸序列中第2位的半胱氨酸残基与10位的半胱氨酸残基之 间成分子内二硫键，形成环状。 本专利技术提供了一种环状多肽，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.3或SEQ ID No.4 的氨基酸序列所示，所述环状结构为其氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间形成二硫键 构成，即氨基酸序列中第2位的半胱氨酸残基与10位的半胱氨酸残基之间形成分子内二硫 键。 本专利技术所述环状多肽，通过N-2位点的半胱氨酸残基与N-10位点的半胱氨酸残基 形成分子内二硫键成环，在环肽结构中N-端的N-5，N-6和N-8位点由具有较长的碱性侧链的 赖氨酸残基构成，具体结构表示如下。 环状多肽1:可表示为卩如序列表SEQ ID No.3所示。 .， 和环状多肽2:可表示为：即如序列表SEQ ID No. 4所 不。 本专利技术多肽的序列特征:长度11个氨基酸构成，其中半胱氨酸中的巯基形成分子 内二硫键;拓扑结构:环状;结构特点：富含碱性氨基酸，环状结构。 本专利技术提供了所述环状多肽在制备金黄色葡萄球菌抑制剂中的应用，以及在制备 治疗与预防金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。 同时，本专利技术提供了一种治疗与预防金黄色葡萄球菌感染的药物组合物，包含环 状多肽1或环状多肽2中的一种或两种的组合，以及药学上可接受的辅料。 本专利技术还提供了一种治疗与预防金黄色葡萄球菌感染的联合用药物，包含环状多 肽1或环状多肽2中的一种或两种的组合和抗生素的联用，所述抗生素选自：青霉素类抗生 素、头孢类抗生素、喹诺酮类抗生素、碳氢霉稀类抗生素、大环内酯类抗生素中的一种或两 种及两种以上的组合。此外，本专利技术还提供了上述环状多肽的制备方法，包括以下步骤： (1)采用固相合成法合成序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多 肽； (2)对步骤(1)制备得到的多肽进行环化； (3)纯化步骤(2)制备得到的多肽。其中，步骤(2)环化方法优选为碘氧化法;步骤(3)所述纯化方法优选采用葡聚糖 凝胶柱进行纯化。 本专利技术的有益效果是:本专利技术制备得到的环状多肽对金黄色葡萄球菌具有显著的 抑制作用；本专利技术多肽的环状结构有利于提高多肽稳定性，并不会对哺乳动物细胞产生明 显的细胞毒性。 本专利技术环状多肽具有显著的抗金黄色葡萄球菌的作用，同时具有良好的稳定性， 而相同氨基酸序列的直链结构的多肽没有明显的抗菌活性。 显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本专利技术上述基本技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或者变更。 以下通过实施例形式的具体实施方法，对本专利技术的上述内容在做进一步的详细说 明，但不应理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实 现的技术均属于本专利技术的范围。 说明书【附图说明】图1:氨基酸序列为SEQ ID No. 1的直链多肽高效液相色谱图 图2:氨基酸序列为SEQ ID No. 1的直链多肽的电喷雾离子化质谱图谱 图3:环状多肽1的高效液相色谱图 图4:环状多肽1的电喷雾离子化质谱图谱 图5:环状多肽2的高效液相色谱图谱 图6:环状多肽2的电喷雾离子化质谱图谱 图7:环状多肽1在不同浓度下的2小时抑菌率 图8:5毫克/毫升环状多肽1在不同作用时间的抑菌率 图9:环状多肽1在不同时间的稳定性实验数据【具体实施方式】实施例1氨基酸序列为SEQ ID No. 1的直链多肽的合成 1)溶胀树脂:称取0. lmmol的Fmoc-甘氨酸-Wang树脂于固相反应器中，加入10ml的 DCM(二氯甲烷），溶胀树脂30min，待树脂充分溶胀，真空抽干溶剂。 2)脱除Fmoc保护基团：在固相合成器中加入20%哌啶/DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶 液15ml洗涤树脂一遍，用真空栗抽干之后加入20%哌啶/DMF溶液15ml，将固相合成器放入 振荡器中，在常温下130rpm震摇30min。反应结束后真空抽干，用DCM洗涤2次，抽滤。 3)Kaiser法检测：用玻璃毛细点样管从反应器中蘸取少量树脂，放入小玻璃管中， 加入3滴水合茚三酮溶液，在沸水浴中加热，观察其变色情况。若无颜色变化则为阴性，若有 颜色变化则为阳性，表明Fmoc保护基洗脱完全或缩合反应未进行完。经检测，滴加水合茚三 酮溶液至步骤2)制备产物后，加热，颜色变为红色。 4)肽链缩合延长：称取3eq Fmoc-Cys(Acm)-OH，3eq(228mg)HBTU(0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯）和3eq(82mg)H0Bt(l-羟基苯并三唑），用DMF溶解后，加入5eq(174yL) DIEA(N，N-二异丙基乙胺)静置2min使其充分活化，充分混合后加入固相合成器，将固相合 成器放入振荡器中常温3小时。缩合完成后，用DCM，DMF依次洗涤树脂。 根据SEQ ID No · 1的氨基酸序列，只是依次替换Fmoc-Cys(Acm)-〇H为Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Cys(Acm)-〇H、Fmoc-Ala本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的氨基酸序列所示，所述多肽通过其氨基酸序列中的2个半胱氨酸残基成分子内二硫键，形成环状。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：常明明，安祥顺，谢阳村，薛飞燕，廉旭凡，温勖，刘灿，赵晓萌，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11