高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株高产柠檬酸黑曲霉菌（Aspergillus niger）FY2013，其保藏编号为CGMCC No.8832。本发明专利技术还提供高产柠檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因组序列（SEQ ID No.59），可用于柠檬酸高效合成功能基因组学、酶学、工程菌株构建、合成其它有机酸（如苹果酸、丁二酸、富马酸等）等研究。本发明专利技术为进一步明晰产柠檬酸黑曲霉遗传特征、基因组背景，掌握柠檬酸合成代谢途径提供了客观依据，为进一步构建更为优越的产柠檬酸菌种提供了可靠数据资料。

【技术实现步骤摘要】
高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用
本专利技术涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用。
技术介绍
柠檬酸是一种非常重要的有机酸，广泛应用于食品工业和日化行业等。目前工业上使用发酵法生产柠檬酸。高产柠檬酸菌种选育在发酵工业中占有重要的地位，几十年来柠檬酸生产菌种黑曲霉的选育研究一直是研究人员关注的焦点。1940年美国科学家克雷伯斯提出三羧循环（TCA循环）学说，柠檬酸的发酵机理逐渐得到认识。含糖类原料生成柠檬酸的生化转化过程中，葡萄糖通过糖酵解途径（EMP途径）生成丙酮酸，丙酮酸进一步氧化脱羧生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A和草酰乙酸（由丙酮酸羧化所生成）缩合成为柠檬酸。柠檬酸是代谢过程中的中间产物。在发酵过程中，当微生物体内的乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，柠檬酸合成酶活性很高时，有利于柠檬酸的大量合成和积累。黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶首先将含有淀粉的原料转变为葡萄糖，葡萄糖经过EMP途径转变为丙酮酸，丙酮酸由丙酮酸氧化酶生成乙酰辅酶A和CO2，继而乙酰辅酶A与草酰乙酸在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用合成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子、同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的α-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，三羧酸循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸大量合成和积累并排出菌体外，其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2→C6H8O7+2H2O柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。柠檬酸菌种的优劣对于柠檬酸产量和生产成本起到重要作用，要实现高产柠檬酸发酵，降低生产成本，柠檬酸菌种的驯化和选育是关键。一株优良的柠檬酸菌种应具备耐高酸和产高酸的性能。本专利技术以黑曲霉菌株FY2010为出发菌种（ACCC30161），从发酵良好产酸高的薯干醪柠檬酸发酵液中分离菌株，通过一系列物理和化学诱变、酸度驯化得到58株耐酸菌株，再复筛得到9株既耐酸又产酸高的菌株，进一步优筛得到1株耐酸、产酸高、高糖酸转化率的优良菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一株高产柠檬酸黑曲霉（Aspergillusniger）FY2013，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.8832，保藏日期2014年2月20日。本专利技术还提供所述黑曲霉FY2013的部分基因组序列，见SEQIDNo.59。其全基因组序列共含34853277个核苷酸。GC含量28.18%，包括313个预测的开放阅读框（ORF）。本专利技术还提供所述黑曲霉FY2013在发酵生产柠檬酸中的应用，包括以下步骤：1）种曲制备：取5mL无菌水至黑曲霉菌株FY2013的培养平板上，用接种环刮下孢子至200mL无菌水中，制成孢子悬液，用于柠檬酸种子罐培养；2）种子罐培养：种子罐中加入20L水，然后称取8kg玉米粉加入种子罐中混匀，加入5mL淀粉酶（90000u/ml），加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，然后将液化液进行固液分离，再将液化后分离的糖液重新装入种子罐中，总糖控制在19.8%，加入20g/L大豆粉，加入2mL消泡剂，121℃加热灭菌20min，然后冷却至37℃，保温，接入制备好的菌株FY2013孢子悬液，37℃进行种子扩大培养，22h后，取少量种子液镜检并测定其pH值，镜检无污染且菌球生长良好，当种子液pH降至3.0时，将种子液接入发酵罐中，进行柠檬酸发酵产酸；3）利用黑曲霉菌株FY2013发酵生产柠檬酸：称取9kg玉米粉、22kg水、6mL淀粉酶，混匀后加热至65-70℃进行糊化30min，再升温至92-95℃液化5min，液化后对液化液进行固液分离，将糖液装入发酵罐中，加入20g/L大豆粉，用柠檬酸调pH为4.8，并加入消泡剂2mL，110℃加热灭菌15min，冷却至37℃，保温，接入上述培养好的种子液，进行柠檬酸发酵，接种量为10%，接种后总糖控制在19.8%，发酵温度为37±1℃，罐压控制0.08MPa，溶氧控制在40%以上，发酵时间60h；其中，步骤1）中使用的培养基配方为：马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂15-20g、蒸馏水1L，pH自然。本专利技术还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的α-淀粉酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的葡萄糖氧化酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.13所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的苹果酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.17所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的乌头酸酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.21所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的α-酮戊二酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.25所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术提供高产柠檬酸黑曲霉菌株FY2013的部分基因组序列（SEQIDNo.59），可用于柠檬酸高效合成功能基因组学、酶学、工程菌株构建、合成其它有机酸（如苹果酸、丁二酸、富马酸等）等研究。本专利技术为进一步明晰产柠檬酸黑曲霉遗传特征、全基因组背景，掌握柠檬酸合成代谢途径提供了客观依据，为进一步构建更为优越的产柠檬酸菌种提供了可靠数据资料，并为我国高产柠檬酸黑曲霉菌种可利用蔗糖作为碳源生产柠檬酸奠定了坚实基础。附图说明图1为本专利技术实施例4中PCR扩增α-淀粉酶基因的凝胶电泳检测结果。图2为本专利技术实施例4中α-淀粉酶SDS-PAGE分析结果。图3为本专利技术实施例5中PCR扩增葡萄糖氧化酶基因的凝胶电泳检测结果。图4为本专利技术实施例6中PCR扩增葡萄糖脱氢酶基因的凝胶电泳检测结果。图5为本专利技术实施例6中葡萄糖脱氢酶SDS-PAGE分析结果。图6为本专利技术实施例7中PCR扩增6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的凝胶电泳检测结果。图7为本专利技术实施例7中6-磷酸葡萄糖脱氢酶SDS-PAGE分析结果。图8为本专利技术实施例8中PCR扩增苹果酸脱氢酶基因的凝胶电泳检测结果。图9为本专利技术实施例9中PCR扩增乌头酸酶基因的凝胶电泳检测结果。图10为本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
黑曲霉（Aspergillus niger）FY2013，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.8832。

【技术特征摘要】
1.与黑曲霉FY2013发酵柠檬酸合成途径相关的α-淀粉酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；其中，所述黑曲霉FY2013的保藏编号为CGMC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣杰，尚海涛，徐斌，
申请(专利权)人：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34