本发明专利技术公开了一种从玉米浆中提取生物素的方法，以玉米浆为原料，经N,N-二甲基甲酰胺提取，无水乙醇提取除杂，丙酮提取除杂，乙酸丁酯和环己烷提取除杂，最终得到含生物素的样品液。本发明专利技术还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法，(1)取待检测样品液，点在涂有硅胶GF254高效薄层板上，加入展开剂，在展开缸内展开，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；(2)展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点；(3)利用Camag3型薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，计算出样品液中生物素的质量浓度。具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从玉米浆中提取生物素的方法，以及生物素的薄层层析扫描检测方法。
技术介绍
生物素是生命活动中必需的维生素之一，是机体内许多酶的辅助因子，参加机体的羧化、脱羧和脱氢反应，参与糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢。生物素已广泛应用于食品、化工、医药、畜牧、生物发酵等领域。在谷氨酸发酵生产中，生物素用量的控制直接影响着生产菌的生长、增殖、代谢和细胞壁、细胞膜的渗透性以及谷氨酸产酸率的高低，由于大多数谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量对生产起着至关重要的作用，因此开展对生物素检测的研究具有重要的意义。在玉米淀粉制造工艺中，玉米粒首先要经亚硫酸稀液浸泡。该浸泡液即为玉米浆，其中生物素的含量丰富，可作为良好的谷氨酸发酵的原料和添加物，是目前谷氨酸生产中生物素的主要来源之一。但由于其中生物素的含量与玉米的来源、生产批次等密切相关，因此，为稳定生产、提高产酸率必须准确测定其中的生物素含量，才可在谷氨酸发酵中实现生物素用量的准确控制。目前文献报道的生物素的检测方法有微生物法、荧光法、分光光度法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法等等。对玉米浆中生物素的检测，微生物法最为常用。微生物法由于大多数菌株都不是专一性的，因此会带来较大的检测误差，并且整个操作过程费时、费力。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种操作简单、可靠的以玉米浆为原料提取生物素的方法，及对提取生物素进行检测的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种从玉米浆中提取生物素的方法，步骤如下:(I)取玉米浆，加入I?2倍(体积倍数)的N，N- 二甲基甲酰胺，加热提取，提取温度为75°C?85°C，提取时间为I?2h，提取后过滤，得提取液和滤渣；用无水乙醇洗涤滤渣3?5次，过滤，合并滤液得乙醇洗涤液，每次无水乙醇的用量与玉米浆的体积相等；将提取液和乙醇洗涤液合并，过滤，滤液经旋转蒸发仪蒸发浓缩至玉米浆体积的8/10?6/10，得浓缩液；(2)向步骤⑴所得浓缩液中加入3倍(体积倍数)的无水乙醇，静置，过滤除去沉淀，滤液再次用旋转蒸发仪蒸发浓缩至玉米浆体积的4/10?3/10，得浓缩液；(3)向步骤⑵所得浓缩液中加入4?5倍(体积倍数)的丙酮，静置，过滤除去沉淀，滤液再用旋转蒸发仪蒸发浓缩至玉米浆体积的2/10，得浓缩液；(4)向步骤(3)所得浓缩液中加入3?4倍(体积倍数)的丙酮，静置，过滤除去沉淀，蒸发浓缩至玉米浆体积的1/20，得浓缩液；(5)步骤(4)所得浓缩液中加入乙酸丁酯和环己烷，乙酸丁酯、环己烷的加入量与浓缩液的体积相同，静置分层；取上清液，即为生物素溶液(含有生物素的溶液)。以上方法中，旋转蒸发的温度为40?60°C。一种生物素的薄层层析扫描检测方法，步骤如下:(I)取待检测样品液(即上述方法制备得到的上清液)4μ 1，点在涂有硅胶GF254高效薄层板(IOcmXlOcm)上，向展开缸加入展开剂,在展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)内展开，展开剂的饱和时间为60分钟，展开距离为6cm，展开时间为15分钟，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点4μ I不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开；所述展开剂为二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的体积比为3:3:2:0.06 ；所述生物素标准品溶液包括浓度分别为0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ I,0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I的一系列标准品溶液；所述生物素标准品溶液的配制方法为:精密称取生物素标准品(购自Sigma公司)1.29mg,加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为lmg/ml的标准溶液；精密吸取50，200，250，300，400μ llmg/ml 的标准溶液，配制成浓度分别 0.05 μ g/μ 1，0.2 μ g/μ 1，0.25 μ g/ μ I, 0.3 μ g/ μ I, 0.4 μ g/ μ I 的一系列标准品溶液；(2)将2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1?0.2% (质量体积分数，单位g/ml)，硫酸终浓度为I?2% (质量体积分数，单位g/ml);展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点(橙红色)；(3)利用Camag3型薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，扫描速度为20mm/s,分辨率为50 μ m/step,得Rf = 0.69 ;照射灯为钨灯，检测计算得到生物素标准品溶液质量和峰面积积分值的关系的回归方程(通过薄层色谱仪管理软件winCATSl.4.1计算出，为常规手段)，然后根据样品液的峰面积积分值计算出样品液中生物素的质量浓度。本专利技术的生物素的提取方法，操作简单，本专利技术的生物素的检测方法，具有简单、快速、准确、可靠、稳定等优点，经薄层层析扫描定量分析，不同批次的玉米浆中生物素含量为 350 ?700mg/L。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1从玉米浆中提取生物素并进行检测提取:取某一批次的玉米浆100ml，向玉米浆中加入200mlN，N- 二甲基甲酰胺，在水浴锅中进行搅拌提取，温度为75°C，提取时间为I小时，过滤得到滤液，并用无水乙醇洗涤滤渣，每次IOOml洗涤3次，合并滤液和洗涤液。混合液过滤后用旋蒸仪蒸发浓缩到80ml，加入240ml无水乙醇搅拌沉淀出部分杂质，过滤后再次用旋蒸仪蒸发浓缩到40ml，再向其中加入200ml丙酮沉淀出大量杂质，过滤后用旋蒸仪浓缩，浓缩到20ml，加入IOOml丙酮沉淀杂质，过滤后旋蒸浓缩到5ml ;与5ml乙酸丁酯和5ml环己烷混合，静置分层，取上清液浓缩到2ml (作为样品液)；所述的旋转蒸发温度为40°C。检测:精密称取生物素标准品(Sigma公司)1.29mg，加入N，N-二甲基甲酰胺1.29ml，配制成浓度为lmg/ml的标准溶液。精密吸取50，200，250，300，400 μ llmg/ml的标准溶液,配制成浓度分别 0.05 μ g/μ 1,0.2 μ g/μ 1,0.25 μ g/μ 1,0.3 μ g/μ 1,0.4 μ g/μ I的一系列标准品溶液，分别取上述所得的样品液4μ I和标准液4 μ 1，点在涂有硅胶GF254高效薄层板(IOcmXlOcm)上，以二氯甲烧(V):氯仿(V):甲醇(V):冰乙酸(V)=3:3:2:0.06的比例配制8.06ml展开剂，在展开缸(IOcmX 12cmX 15cm)内层析，展开剂的饱和时间为60分钟，展开距离为6cm，展开时间为15分钟，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干。将2，4- 二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4- 二甲氨基肉桂醛浓度为0.1%，硫酸浓度为1%，晾干后的薄层板用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显橙红色的标准品斑点和样品斑点。利用Camag3型薄层扫描仪以530nm吸收波长进行薄层层析扫描，扫描速度为20mm/s,分辨率为50 μ m/st印，得Rf = 0.69。照射灯为钨灯，检测计算以生物素标准品的质本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从玉米浆中提取生物素的方法，其特征在于：步骤如下：(1)取玉米浆，加入1～2倍的N,N‑二甲基甲酰胺，加热提取，提取温度为75℃～85℃，提取时间为1～2h，提取后过滤，得提取液和滤渣；用无水乙醇洗涤滤渣3～5次，过滤，合并滤液得乙醇洗涤液，每次无水乙醇的用量与玉米浆的体积相等；将提取液和乙醇洗涤液合并，过滤，滤液蒸发浓缩至玉米浆体积的8/10～6/10，得浓缩液；(2)向步骤(1)所得浓缩液中加入3倍的无水乙醇，静置，过滤除去沉淀，滤液蒸发浓缩至玉米浆体积的4/10～3/10，得浓缩液；(3)向步骤(2)所得浓缩液中加入4～5倍的丙酮，静置，过滤除去沉淀，滤液蒸发浓缩至玉米浆体积的2/10，得浓缩液；(4)向步骤(3)所得浓缩液中加入3～4倍的丙酮，静置，过滤除去沉淀，蒸发浓缩至玉米浆体积的1/20，得浓缩液；(5)步骤(4)所得浓缩液中加入乙酸丁酯和环己烷，乙酸丁酯、环己烷的加入量与浓缩液的体积相同，静置分层；取上清液，即为生物素溶液。
【技术特征摘要】
1.一种从玉米浆中提取生物素的方法，其特征在于:步骤如下: (1)取玉米浆，加入I~2倍的N，N-二甲基甲酰胺，加热提取，提取温度为75°C~85°C，提取时间为I~2h，提取后过滤，得提取液和滤渣；用无水乙醇洗涤滤渣3~5次，过滤，合并滤液得乙醇洗涤液，每次无水乙醇的用量与玉米浆的体积相等；将提取液和乙醇洗涤液合并，过滤，滤液蒸发浓缩至玉米浆体积的8/10~6/10，得浓缩液； (2)向步骤(1)所得浓缩液中加入3倍的无水乙醇，静置，过滤除去沉淀，滤液蒸发浓缩至玉米浆体积的4/10~3/10，得浓缩液； (3)向步骤(2)所得浓缩液中加入4~5倍的丙酮，静置，过滤除去沉淀，滤液蒸发浓缩至玉米浆体积的2/10，得浓缩液； (4)向步骤(3)所得浓缩液中加入3~4倍的丙酮，静置，过滤除去沉淀，蒸发浓缩至玉米浆体积的1/20，得浓缩液； (5)步骤(4)所得浓缩液中加入乙酸丁酯和环己烷，乙酸丁酯、环己烷的加入量与浓缩液的体积相同，静置分层；取上清液，即为生物素溶液。2.根据权利要求1所述的从玉米浆中提取生物素的方法，其特征在于:所述蒸发浓缩的温度为40~60°C。3.—种生物素的薄层层析扫描检测方法，其特征在于:步骤如下: (1)取待检测样品液，点在硅胶板上，加入展开剂，在展开缸内展开，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开； 所述展开剂为二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的体积比为3:3:2:0.06 ； (2)将2，4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2，4- 二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1~0.2%，硫酸终浓度为I~2%;展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯木香，刘代成，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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