本发明专利技术提供了对植物病毒和植物细菌具有抑制作用的活性物质的制备方法及其用途。制备方法是以贵州魁蒿为原料，晒干后粉碎，用乙醇提取；将乙醇提取物用氯仿萃取；将氯仿萃取层也减压浓缩得到粗提物；将氯仿粗提物经硅胶柱层析，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯混合洗脱剂进行梯度洗脱，再经若干次硅胶柱层析法等纯化手段，得到两个单体化合物，分别是8α-羟基蒿萜和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮。经生物活性测试表明，单体化合物I对黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒等植物病毒有较好的防治作用。5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮对番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病等细菌性病害病原菌具有良好的抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了对植物病毒和植物细菌具有抑制作用的活性物质的制备方法及其用途。制备方法是以贵州魁蒿为原料，晒干后粉碎，用乙醇提取；将乙醇提取物用氯仿萃取；将氯仿萃取层也减压浓缩得到粗提物；将氯仿粗提物经硅胶柱层析，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯混合洗脱剂进行梯度洗脱，再经若干次硅胶柱层析法等纯化手段，得到两个单体化合物，分别是8α-羟基蒿萜和5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮。经生物活性测试表明，单体化合物I对黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒等植物病毒有较好的防治作用。5,4’-二羟基-6,7,3’-三甲氧基黄酮对番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病等细菌性病害病原菌具有良好的抑制作用。【专利说明】魁蒿有效成分提取方法及该成分在抗植物病害中的应用
本专利技术属于植物源农药
，涉及能抑制植物病害活性物质的制备方法及其应用，具体的说，是以产于贵州的一种植物-魁蒿为原料，采用各种化学手段和方法提取其中的活性物质，活性物质对植物病毒和细菌病菌具有较高抑制作用。
技术介绍
植物病毒是一类危害大且难防治的植物病害，有“植物癌症”之称，一旦发病，很难防治。黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒是粮经作物生产中的主要病毒病，农作物受其危害而不同程度的减产、影响品质，甚至绝收。据统计，全世界每年由黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒的危害就造成约数十亿多美元的经济损失，目前我国农作物受其危害而损失严重，且尚无特效的防治药剂。目前，市场上销售的大多数抗作物病毒制剂防治效果差，缺乏有效防控技术。因此，寻找具有高效、低毒、及环境友好型抗病毒活性药物已成为当前亟待解决的问题。植物细菌病害与病毒病害一样，呈现出发生频度高、成灾重、发生范围广、防控难度大、危害程度重等特点，给农业生产造成了巨大的经济损失，严重影响我国粮食与经济作物生产安全。目前市场上用于防治植物细菌的农药主要是铜制剂，如噻菌铜、可杀得等，但铜制剂易被雨水冲刷而失去药效，持效期太短，防治效果差等。因此，研究和开发高效、低毒、低残留、环境友好型抑制植物细菌病害的农药迫在眉睫。研究发现，很多天然植物中的化学成分，具有高效、低毒，低残留以及环境友好的特点，因此，提取天然产物中的有效化学成分，寻找到具有较高活性的先导化合物，已成为当前研究绿色农药的热点之一。魁蒿属于菊科蒿属多年生草本植物，学名princeps?wiQ.又名野艾蒿，王侯蒿(云南)，五月艾(广东)，野艾(湖南)，艾叶、黄花艾、端午艾(广西)。多产于我国辽宁(南部)、内蒙古(东南部)、河北(南部)、山西(南部)、陕西(南部)、甘肃(南部)、山东、江苏、安徽、江西、福建、台湾、河南、湖北、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南；多生于低海拔或中海拔地区的路旁、山坡、灌丛、林缘及沟边。此外，该植物在日本、朝鲜也有分布。魁蒿作为一味中药具有祛风除湿、调经安胎等功效。民间入药，作“艾”的代用品，有逐寒湿、理气血、调经、安胎、止血、消炎等的功效。据文献报道，魁蒿含有的主要化学成分可分为挥发油、倍半萜、黄酮以及留体等。据《中华本草》中记载，魁蒿叶中含有挥发油0.45%-1.00%，有2-甲基丁醇、2-己烯醛等60种成分，还有黄酮类、桉叶烷类、三萜类等成分；魁蒿叶具有平喘、镇咳、祛痰、消炎等作用。临床上用于治疗慢性支气管炎、肺气肿、支气管哮喘等。(《中华本草》编委会.《中华本草》.上海，上海科学技术出版社，.第十九卷(7).668.)2011年，Ryu等报道了魁蒿的挥发油及其成分能够抑制皮肤的瘙痒症状，作者以成年大鼠为试验品做止痒试验，结果表明，魁蒿的挥发油及其化学成分-叶绿醇能够明显抑制过敏性细胞因子(NF-rB，AP-1)的激活和表达，从而达到抑制皮肤瘙痒的作用(Ryu，K.R.; Choi J.Y.; Chung S.; et al.Ant1-scratching Behavioral Effectof theEssential Oil and Phytol Isolatedfrom Artemisia princepsPamp.1n Mice.Planta Med, 2011, 77: 22-26.) 2011年，Trinh等报道了魁蒿挥发油的主要化学成分对加德纳菌和白色念珠菌具有较好的抑制作用，作者以成年大鼠为试验品做止痒试验，发现了魁蒿的挥发油及其化学成分能够抑制大鼠体内微生物的生长，其中松油醇能够很好的抑制大鼠体内加德纳菌和白色念珠菌的生长，其MIC值可达到0.06和0.125%(V/V)。(Trinh, H.T.;Lee, 1.A.; Hyun, Y.J.; et al.Artemisia pr in ceps? amp.Essential Oil andIts ConsitituentsEucalyptol and a -terpineol AmeliorateBacterial Vaginosisand Vulvovaginal Candidiasisin Mice by Inhibiting Bacterial Growth andNF-尤 BActivation.Planta Med, 2011, 77: 1996-2002.) 总之，魁蒿对部分植物真菌病菌具有一定的抑制作用，然而，该植物在农用活性的研究较少，因此，本专利技术的专利技术人对魁蒿的化学成分进行提取和分离，研究其在农用活性方面的作用，发现了其中的化学成分8 α -羟基蒿萜对烟草花叶病毒有良好的抑制作用，5，4’ - 二羟基-6，7，3’ -三甲氧基黄酮对抗植物病毒和细菌病害具有较好的抑制作用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:针对缺乏黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹叶枯病毒和番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病的防治药物或药剂，提供对抗植物病毒和细菌病害具有较高抑制作用的植物源活性化合物的提取方法。专利技术人在研究中发现黔产魁蒿中的化学成分8 α -羟基蒿萜即化合物I在钝化作用方面对黄瓜花叶病毒病、烟草花叶病毒病、南方水稻黑条矮缩病毒病和水稻条纹 叶枯病毒有良好的抑制作用，5，4’- 二羟基_6，7, 3’- 二甲氧基黄酮即化合物II对番茄青枯病菌、烟草青枯病菌、水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病具有较好抑制作用。为达到上述目的，本专利技术提供贵州魁蒿中单体化合物8 α -羟基蒿萜和5，4’- 二羟基-6，7，3’ -三甲氧基黄酮的提取方法及其分别在抗植物病毒和细菌病害中的应用: 本专利技术魁蒿有效成分的提取方法，所指魁蒿的有效成分为8α-羟基蒿萜，简称化合物I和5，4’ - 二羟基-6，7，3’ -三甲氧基黄酮，简称化合物II，其结构式分别为:【权利要求】1.魁蒿有效成分的提取方法，其特征在于:所指魁蒿的有效成分为80.-羟基蒿萜，简称化合物I和5，4’ - 二羟基-6，7，3’ -三甲氧基黄酮，简称化合物II，其结构式分别为: 2.按照权利I所述的魁蒿有效成分在抗植物病害中的应用，其特征在于:根据8α-羟基蒿萜即化本文档来自技高网...
【技术保护点】
魁蒿有效成分的提取方法，其特征在于：所指魁蒿的有效成分为8α‑羟基蒿萜,简称化合物I和5,4’‑二羟基‑6,7,3’‑三甲氧基黄酮,简称化合物II,其结构式分别为:化合物I和化合物II的提取方法按下列步骤进行:（1）以产于贵州的魁蒿为原料，晒干后粉碎，并在85%工业乙醇中加热回流提取2次，每次2.5小时，过滤后将滤渣用70%的工业乙醇加热回流提取2小时，过滤，将三次滤液合并，然后再减压浓缩除醇，得到乙醇提取物;（2）向乙醇粗提物加少量蒸馏水，并将其在超声仪中分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩脱除溶剂后，得到石油醚层提取物、氯仿层提取物、乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物和水层提取物;（3）将上述氯仿层提取物用无水乙醇溶解，经硅胶柱层析，然后依次用石油醚：乙酸乙酯=20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测后合并相同组分，共得到8个部分粗分段：Fr.1～Fr.8;（4）将上述Fr.4 部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到5个部分：Fr.4‑1～Fr.4‑5；其中所得Fr.4‑3部分，再以硅胶柱层析法分离纯化，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=3:1洗脱，所得流分减压脱溶后，得到白色粉末状固体，经丙酮重结晶后，得到白色粉末状固体32 mg，经1H NMR、13C NMR及LC‑MS鉴定结合文献对照，确定其为8α‑羟基蒿萜;（5）将上述Fr.5部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、乙酸乙酯进行梯度洗脱，TLC检测并合并相同组分，共得到8个部分:Fr.5‑1～Fr.5‑8;（6）将上述Fr.5‑3部分，以硅胶柱层析法分离，依次用石油醚：乙酸乙酯=4:1、3:1、2:1、1:1进行梯度洗脱，当用石油醚：乙酸乙酯=2:1洗脱剂进行洗脱，并减压浓缩时，有大量黄色絮状物析出，用石油醚：丙酮=1:2的混合溶剂重结晶该黄色絮状物，最后得到黄色粉末状固体143mg，经1H NMR、13C NMR及LC‑MS鉴定结合文献对照，确定其为5,4’‑二羟基‑6,7,3’‑三甲氧基黄酮。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋宝安，韩宇，胡德禹，薛伟，万治华，陈美航，金林红，贺鸣，陈卓，李向阳，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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