本发明专利技术的主题是一种通过多拷贝整合至少4种表达盒制备遗传修饰酵母的方法，其允许以高滴度生产目标分子。本发明专利技术的主题还为根据所述方法转化的酵母及其用于生产氢化可的松的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术的主题是一种通过多拷贝整合至少4种表达盒制备遗传修饰酵母的方法，其允许以高滴度生产目标分子。本专利技术的主题还为根据所述方法转化的酵母及其用于生产氢化可的松的用途。【专利说明】本专利技术的一个主题是一种通过多拷贝整合至少4种表达盒制备遗传修饰酵母的方法，其允许以高滴度生产目标分子。本专利技术的主题还为根据所述方法转化的酵母及其用于生产氢化可的松的用途。重组蛋白质生产因为面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有与哺乳动物相关的真核细胞特性，而且因为其具有遗传操作的容易性、基因组序列的可获生、对这类微生物大规模发酵过程的控制以及对人类、动物或植物没有危险(分类为GRAS，通常认为安全的)，因此其被选择作为用于生产重组蛋白的宿主生物体，所述特性包括合成蛋白的翻译后修饰，如乙酰化、磷酸化和糖基化。这些特性已经使其成为广泛用于食品加工工业以及更近来用于药物领域的生物体选择。酿酒酵母凭借其在天然状态下合成各种代谢产物如酶、有机酸、多糖或感官化合物的能力，可用于生产具有多种工业用途的化合物。尤其是，多种内源性脂肪酸和固醇可用于生产美容学上或药学上的制剂，如从麦角固醇产生的维生素原D2。内源性固醇化合物还是在酿酒酵母菌株经遗传工程改造后可获得的异源分子的前体。实例包括紫杉二烯-5-乙酰氧基-10-醇(紫杉醇的前体)、青蒿酸(一种为抗疟药剂组合物的一部分的化合物)以及类固醇激素。酿酒酵母中生产氢化可的松在氢化可的松首次上市后超过50年，仍然是因为其抗炎特性而使用的治疗分子，或作为衍生的类固醇物质的合成中间体。 目前，类固醇的生产与包括生物转化步骤和数个化学合成步骤的昂贵且污染性提取或合成方法相关。已在寻找较低廉的替代方法的开发。这样的方法的开发起始于1990年代。它涉及使用遗传修饰的酿酒酵母菌株。概念证据在1999年证明，并随后得到确认(W002/061109 ；MenardSzczebara等，2003)。对酵母进行修饰以表达教种异源蛋白并使数种内源蛋白失活，以消除寄生反应。这些修饰的酵母菌株能通过从简单的碳源发酵作用，经由该生物体内重组的哺乳动物生物合成途径生产氧化可的松(Brocard-Masson 和 Dumas, 2006 ；Dumas B.等，2006)。然而，这些最早的菌株显示生产氢化可的松的能力低，而且因此不满足工业生产的需要。酵母转化方法增加菌株生产力的一个策略是改进用于将异源基因引入到酵母细胞中的转化方法。转化方法通常伴有根据合适的方法选择最佳的转化体。在用于酵母菌林转化的常规方法中，特别可提及的是由Ito等人(1983)或Klebe等人(1983)所建议的方法。在用线性DNA片段转化的特定情况下，优选使用如由Becker和Lundblad (2001)建议的原生质球转化技术。为了增加蛋白表达，一种策略是将数个拷贝的目标基因引入到酵母菌株中。通常酵母载体是自主复制质粒，其含有编码可选择标记的基因以及2μπι酵母复制起点(Broach, 1983) 0 2 μ m起点允许多拷贝质粒存在于每个细胞中。选择压力用于将质粒保留在细胞中(即，将细胞培养在化学成分确定的培养基中，使得只有带有携带选择生标记的质粒的细胞才能生长)。然而，自主复制、高拷贝载体的使用并不适用于使用复杂原材料的某些工业生产方法。此外，可以克隆到所述质粒载体上的基因的数目通常限于2种或3种表达盒，因为质粒的大小影响转化和复制的效率。Lopes等人(1989和1991)已经描述了另一种策略。该策略包括构建用于多重整合到酵母核糖体DNA中的称为pMIRY2的多重整合载体，其靶向酿酒酵母基因组的核糖体DNA(rDNA)。将由pMIRY2质粒携带的待表达的目标基因插入到由位于染色体XII上的大约100到200个串联重复单元组成的核糖体DNA中。开始时其以低拷贝数整合于rDNA基因座，然后可通过应用强选择压力进行扩增(Lopes等1991)。然而，将多拷贝质粒整合到核糖体DNA中的应用也具有局限生:该方法仅仅描述用于引入伴随有可选择标记的单一目标基因。因此，结合经由2μπι复制质粒引入多拷贝基因的优点与经由整合质粒稳定整合基因的优点，使得能够有效共表达教种蛋白是有益的。本专利技术人已经证实，通过稳定多拷贝整合至少4种目标基因的表达盒，获得适于工业规模生产的生 产高滴度目标分子的酵母是可能的。因此，利用本专利技术可以实现至少4个不同基因的高水平表达，其中每个基因都以多拷贝存在。专利技术概述本专利技术提供了一种用于获得在稳定多拷贝整合至少4种表达盒以后以高滴度生产目标分子的酵母的简单且快速的方法。多拷贝整合允许在选择最佳转化体以后目标转基因的高水平表达。这种方法使通过提供酵母相同代谢途径或不同代谢途径的各种基因对酵母进行修饰成为可能。因此，经过修饰，酵母获得了将内源分子或外源底物转变成目标产物的能力。因此，这种转化酵母可用作生产目标分子的定制生物工具，所述目标分子包括重组蛋白。本专利技术的一个具体主题是一种通过应用本专利技术的方法获得的酵母，其表达3 β -羟基类固醇脱氢酶(3 β -HSD)、类固醇11 β -羟化酶(亦称为P450cll (CYP11B1)、细胞色素Ρ450侧链裂解酶(或P450SCC) (CYP11A1)和皮质铁氧还蛋白(ADX)。一种除了表达上述4个基因外还表达固醇八7-还原酶、类固醇17 0-羟化酶(0￥?17八1)和类固醇21-羟化酶(CYP21A1)的酵母，可用于将内源性固醇转变成氢化可的松。专利技术详述本专利技术的主题是一种用于制备生产高滴度目标分子的遗传转化酵母的方法，其包括:(i)稳定多拷贝整合至少4种表达盒，然后(ii)选择其为最佳生产者的酵母。根据本专利技术的稳定多拷贝整合至少4种表达盒的步骤基于两种整合质粒的共转化，每种质粒包含至少2种目标转基因的表达盒和任选包含可选择标记。短语“表达盒”，也称为“转基因”，意指包括存在于所转化的酵母菌株中的内源DNA序列、所转化酵母菌株中不存在的外源DNA序列以及结合内源和外源DNA序列的异质DNA序列。表达盒可包含基因表达所需的侧翼元件，其包括启动子和/或终止子。为了确保酵母中的良好表达，启动子或终止子可选自来源于酵母的序列。可使用的启动子包括来源于糖酵解相关基因的启动子，如=PGK基因(编码3-磷酸甘油酸激酶)的启动子、GAPDH(TDH3)基因(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的启动子、ADHl基因(编码乙醇脱氢酶I)的启动子、ENOl基因(编码烯醇酶I)的启动子或TPll基因(编码磷酸丙糖异构酶)的启动子。也可以使用诱导型启动子，其包括:受半乳糖调控的GAL基因之一的启动子或GAL10/CYC1杂合启动子、由氧调控并受葡萄糖抑制的CYCl基因(编码异-1-细胞色素C，一种线粒体电子转运体)1启动子、MET25基因(编码O-乙酰基高丝氨酸(硫醇)裂解酶)的甲硫氨酸-阻抑型启动子、MET3基因(编码ATP硫酸化酶)的甲硫氨酸-诱导型启动子、CUPl基因(编码铜螯合蛋白)的铜诱导型启动子和受高浓度铜抑制并受低浓度铜诱导的CTRl和CTR3基因(编码膜铜转运体)的启动子。也可以使用TEFl基因(编码转录延伸因子)的启动子和PMAl基因(编码膜质子转运体ATP酶)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备生产氢化可的松的酵母分离菌的方法，包括：(a)提供具有4种表达盒的两种整合质粒，每种整合质粒包含至少两种表达盒并任选包含可选择标记，其中所述4种表达盒是P450scc、皮质铁氧还蛋白(ADX)、P450c11和3β‑羟基类固醇脱氢酶(3β‑HSD)；(b)通过将所述质粒共转化到酵母中，将多拷贝的两种整合质粒稳定整合到酵母细胞群体中；(c)进行初次筛选以选择至少30个酵母克隆，其中克隆的选择基于表达盒的存在，或者当所述标记存在时基于可选择标记表达的选择；和(d)对初次筛选中选择的至少30个酵母克隆进行功能性二次筛选，以鉴定生产氢化可的松的酵母分离菌。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·布罗卡德马森，I·邦宁，B·杜马斯，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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