作为检测日光照射、前列腺癌和其它癌症的诊断工具的线粒体突变及重排制造技术

本发明专利技术提供了可用于对于检测癌症和日光照射的线粒体DNA缺失。具体地，提供了检测线粒体DNA缺失以用于前列腺癌、日光照射和非黑色素瘤皮肤癌的早期检测、诊断和发展的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为200680021903.1的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/CA2006/000652的中国国家阶段申请。 
本专利技术涉及线粒体基因组学领域。具体地，其涉及线粒体基因组中的突变和重排，及其作为日光照射、衰老和疾病的发生或存在的指示因子的功用，例如在一般的临床症状显现之前检测肿瘤形成前、肿瘤形成以及向潜在恶性转化的进展。 
技术介绍
当前生物科学中的大趋势是人类基因组计划以及该数据的商业开发。然而，对这些信息的利用和实行存在例外的限制，因为该数据在个体水平上不是特异性的。令人难以置信的是，该数据仅来自少量个体，难以代表人类种群中存在的变异，从而使得该数据只能用于一般应用。人类基因组惊人的复杂性使基于个体基础的应用并不实际。为了对一个人类细胞核基因组进行完整测序，美国能源部和国立卫生研究院从1988年起已投资25亿美元(http://www.ornl.gov/hgmis/project/budget.html)。 线粒体基因组 线粒体基因组是紧凑但却至关重要的核酸序列。线粒体基因组编码细胞呼吸所必需的酶亚基。与33亿bp的庞大核基因组相反，线粒体DNA(或“mtDNA”)是16,569个碱基对(bp)的小核酸基因组(Anderson 等，1981；Andrews等，1999)。其遗传互补体比其同细胞的核小得多(0.0005％)。然而，个体细胞带有103至104中任意数目的线粒体，这取决于特定的细胞功能(Singh and Modica-Napolitano2002)。在细胞核和线粒体基因组之间一般存在通讯或化学信号转导(Sherratt等，1997)。而且，特定的细胞核组分负责线粒体序列的维持和完整性(Croteau等，1999)。当这些细胞核区域由于指示潜在疾病的细胞核重排而失去功能时，接着 mtDNA序列中也会开始出现突变。另外，可以通过线粒体基因组中由体细胞突变推动的缺失来对细胞内破坏鉴定特异性线粒体。这种理论性机制也可以用于指示将发生的疾病。线粒体需要约3,000种基因，其中只有37种由线粒体基因组编码，表明了线粒体对细胞核基因座的严重依赖(Naviaux，1997)。 一旦发生受精，由于卵细胞中线粒体的克隆扩增，给定个体中所有线粒体DNA(mtDNA)基因组是相同的。mtDNA的关键作用是产生驱动细胞代谢的细胞燃料——三磷酸腺苷(ATP)。重要地，除了由线粒体基因组提供的13种多肽以外，该线粒体基因组依赖70种细胞核编码的蛋白质来完成该生命功能所必需的氧化和还原反应(Leonard和Shapira，1997)。不同的组织和器官对氧化磷酸化的依赖程度不同。与氧化磷酸化(OXPHOS)缺陷相关的疾病看来与mtDNA突变有紧密的联系(Byrne，1992)。由于mtDNA突变的严重性提高而导致OXPHOS降低而超出了器官特异性能量阈值，这引起多种临床表型。而且，线粒体基因组中的突变与多种慢性退行性疾病有关(Gattermann等1995)。众所周知，衰老和特定类型的疾病可以使mtDNA发生改变或突变，使细胞的能量产生能力受损。这常常导致缺陷线粒体的过表达和/或细胞通过增加糖酵解来补充ATP的缺乏(Carew和Huang，2002)；因此，当以连续的间隔进行监测时，线粒体基因组中的改变或突变可以用作疾病发生和/或疾病发展的标记。 最近，Fliss等(2000)在来自肺及膀胱的癌症的原发性肿瘤中发现了天然情况下主要为同质的mtDNA发生高频率突变，表明突变mtDNA在恶性肿瘤细胞中占多数。点突变和缺失看来是氧自由基对线粒体膜和基因组造成损伤的非程序性但却不可避免的副作用(Miquel等1992)。这个理论看来言之有理，不仅因为线粒体基因组缺乏保护性组蛋白，还因为在产生氧的线粒体内膜附近发现了对氧化损伤的敏感性。而且，由于mtDNA具有紧凑的基因组并缺少内含子，因此有害事件很可能影响编码序列，引起生物化学功能异常。这种功能异常将进一步增加细胞的氧化应激，这将引起核及mtDNA的损伤，从而提高细胞进入癌化过程的可能性(Penta 等，2001)。在这方面，研究表明随着年龄的增长，mtDNA的损伤增加(Cortopassi&Wang1995)，呼吸功能随之衰退(Miquel等1992)，最终导致细胞死亡。 mtDNA作为诊断工具 mtDNA序列动力学情况是重要的诊断工具。mtDNA中的突变常常是正在发展中疾病的先期指示，常常与细胞核突变有关，并作为与疾病特异性相关的生物标志物，所述疾病例如但不仅限于：吸烟和接触二手烟引起的组织损伤和癌症(Lee等，1998；Wei，1998)；基于从约20岁开始并在之后逐渐提高的线粒体基因组突变累积的寿命((von Wurmb，1998)；由突变或接触致癌物、诱变剂、紫外线辐射照射而引起的转移性疾病(Birch-Machm，2000)；骨关节炎；心血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森病(Shoffner等，1993；Sherratt等，1997；Zhang等，1998)；与年龄相关的听力丧失(Seidman等，1997)；视神经退化和心率失常(Brown等，1997；Wallace等，1988)；慢性进行性external exophthalmoplegia (Taniike等，1992)；动脉硬化(Bogliolo等，1999)；乳头状甲状腺癌和甲状腺瘤(Yeh等，2000)等等(例如Naviaux，1997；Chinnery and Turnbull，1999)。 线粒体基因组特定位点的突变可与某些疾病相关。例如，在4216、4217和4917位的突变与Leber′s遗传性视神经病变(LHON)(Mitochondrial Research Society；Huoponen(2001)；MitoMap)相关。在5/5个泛醇细胞色素C还原酶(复合体III)缺陷的患者中发现了15452位的突变(Valnot等1999)。然而，还未这些位点的突变与前列腺癌有关。 具体地，这些改变包括点突变(转换、颠换)、缺失(一个碱基至数千个碱基)、倒位、复制(一个碱基至数千个碱基)、重组以及插入(一个碱基至数千个碱基)。另外，特定的碱基对改变、缺失或其组合与前列腺癌、皮肤癌和肺癌的早期发作以及衰老(例如Polyak等，1998)、提前衰老、接触致癌物(Lee等，1998)等有关。 因为mtDNA仅通过卵细胞向后代传递，所以急需通过这种遗传手段了解线粒体序列。mtDNA的序列在母系谱系之间有广泛的变异(Ward等，1991)，因此，必须与这种变异相比清楚地了解与疾病相关的突变。例如，若干个体的序列中与特定癌症相关的特定T向C的转换实际上可能是在给定的特定地理区域或与种族相关的母系谱系中广泛的天然变异。例如，北美本地人表现出异常高的成年糖尿病发病频率。另外，所有的北美本地人在遗传上可表征为5个基本的母系谱系，命名为A、B、C、D和X(Schurr等，1990；Stone和Stoneking，1993；Smith等，1999)本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失的方法，其中所述缺失与皮肤癌和/或UV照射有关，所述方法包括检测生物样品的mtDNA中所述缺失的存在情况。

【技术特征摘要】
2005.04.18 US 60/672,016;2005.09.29 US 60/721,522;1.用于检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸
的缺失的方法，其中所述缺失与皮肤癌和/或UV照射有关，所述方法包
括检测生物样品的mtDNA中所述缺失的存在情况。
2.权利要求1的方法，其中所述生物样品是来自受试者的皮肤样
品。
3.权利要求1的方法，其中所述生物样品是组织培养样品。
4.权利要求3的方法，其还包括在检测所述缺失的存在情况的步骤
前将所述组织培养样品暴露于至少一个亚致死剂量的紫外线辐射
(UVR)。
5.权利要求4的方法，其中将所述生物样品暴露于一系列重复性亚
致死剂量的UVR。
6.权利要求5的方法，其中所述系列包括将所述生物样品暴露于日
剂量的UVR。
7.权利要求4的方法，其中所述UVR来自模拟太阳的UVR源。
8.权利要求4的方法，其中所述UVR包含UVA、UVB或UVA/UVB。
9.权利要求1的方法，其中所述方法用于检测皮肤癌。
10.用于测定累积性UV照射的方法，所述方法包括在生物样品中
检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失的存
在情况。
11.用于监测临床UV光疗方案的长期安全性的方法，所述方法包
括在生物样品中检测跨越人mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核
苷酸的缺失的存在情况。
12.用于监测日光照射或相关的非黑色素瘤皮肤癌(NMSC)的方
法，所述方法包括在经一段时间间隔获得的生物样品中检测跨越人
mtDNA基因组劣弧中约547至4443位核苷酸的缺失的存在情况。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述缺失为约3895bp。
14.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述缺失包含从D-环
中的mtTF1结合位点左右至tRNA甲硫氨酸的mtDNA段。
15.权利要求1的方法，其中所述缺失基本上包含12s rRNA基因、
16s rRNA基因、ND1基因以及用于H和L链转录的启动子。
16.权利要求1至12中任一项的方法，其中检测mtDNA中所述缺
失的存在情况的步骤包括扩增所述mtDNA。
17.权利要求1至12中任一项的方法，其中检测mtDNA中所述缺
失的存在情况的步骤包括选自以下的PCR分析：缺失特异性PCR分析，
放射性PCR分析，定量PCR，实时PCR(RT-PCR)分析或使用重组、
热稳定Taq DNA聚合酶的RT-PCR。
18.权利要求1至12中任一项的方法，其中检测mtDNA中所述缺
失的存在情况的步骤包括使用跨过mtDNA接合处的引物的PCR分析，
所述接合处由跨越约547至4443位核苷酸的所述缺失形成。
19.权利要求17的方法，其中使用跨过mtDNA接合处的PCR引
物进行所述PCR分析，所述接合处由跨越约547至4443位核苷酸的所
述缺失形成。
20....

【专利技术属性】
技术研发人员：瑞安·帕尔，罗伯特·塞耶，加百利·道库博，珍妮弗·克里德，克里·鲁宾逊，安德烈娅·马格拉，布赖恩·赖古伊，安德烈·哈博特尔，马克·比尔克马金，
申请(专利权)人：米托米克斯公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA