一种可保持蛋白质活性的软骨组织分级处理方法技术

本发明专利技术涉及一种可保持蛋白质活性的软骨组织分级处理方法，通过切片处理，可以将软骨组织切成厚度为5-20μm的切片，在此过程中软骨组织中的细胞多数被切割破裂。再经反复冻融处理后，细胞结构均被破坏。将组织切片置于提取溶液中，搅拌超声处理。将组织片取出，获得的细胞类成分A。将取出的组织片再置于清洗溶液中，搅拌超声处理，彻底清除细胞类成分。将取出的组织切片置超纯水溶液中搅拌。将组织切片吸干水分后获得基质类成分B。用适当溶剂提取基质成分B中的蛋白质类物质，进行组学分析和活性实验。本发明专利技术的优点为：可以实现软骨组织中，细胞类成分和细胞外基质类成分的分离。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，通过切片处理，可以将软骨组织切成厚度为5-20μm的切片，在此过程中软骨组织中的细胞多数被切割破裂。再经反复冻融处理后，细胞结构均被破坏。将组织切片置于提取溶液中，搅拌超声处理。将组织片取出，获得的细胞类成分A。将取出的组织片再置于清洗溶液中，搅拌超声处理，彻底清除细胞类成分。将取出的组织切片置超纯水溶液中搅拌。将组织切片吸干水分后获得基质类成分B。用适当溶剂提取基质成分B中的蛋白质类物质，进行组学分析和活性实验。本专利技术的优点为：可以实现软骨组织中，细胞类成分和细胞外基质类成分的分离。【专利说明】
本专利技术涉及用于蛋白质活性分析及功能蛋白质组学研究的软骨组织分级提取方法，具体地说是一种基于组织切片和去细胞化处理的软骨组织分级处理方法的构建。
技术介绍
软骨组织主要由软骨细胞及其分泌形成的细胞外基质构成。在对软骨组织进行蛋白质组学分析时，通常对整块软骨组织进行处理。此时，细胞外基质中的高丰度蛋白类成分，如胶原蛋白、纤维联接蛋白等会严重干扰细胞内蛋白质的鉴定。反之，如果想分析细胞外基质中的蛋白质组成变化，细胞内蛋白质也会带来很大的干扰。通过研究发现，软骨组织中的细胞外基质具有较强的机械强度，切成厚度为IOym的厚度时仍能保持较好的片状形态。而此时，细胞外基质中的软骨细胞基本都被切割而碎裂。将软骨组织切片置于提取溶液中，细胞类成分会释放到溶液中，而细胞外基质类成分因为水溶性较差，很少溶解到溶液中。通过收集提取溶液，可以获得细胞类成分，同时排除了细胞外基质类成分的干扰。经过多种溶剂反复冲洗，将残留的细胞类成分彻底清洗干净，可以获得细胞外基质类成分，同时排除细胞类成分的干扰。在对蛋白质提取物的分析中，认识其蛋白质组成与发现其生物活性都是非常重要的。传统的蛋白质组学研究中，往往应用变性剂或表面活性剂提取蛋白质。这虽然能提高蛋白质的提取效率，但是由于蛋白质已经变性失活，所以无法对其进行活性研究。因此，如何在保持活性的条件下对蛋白质进行提取是需要解决的重要问题。因此，选用冷冻切片技术和非变性溶剂，发展顺序提取方法，实现软骨组织样品中细胞类成分和细胞外基质类成分的分级处理，对于蛋白质组学研究和活性蛋白质的发现具有较大意义。鹿茸作为哺乳动物唯一能够完整持续再生的器官，在较短时时期内可以产生大量的血管、神经、软骨等组织，被认为是研究组织生长调节机制的理想模型。鹿茸的前软骨区不同于一般的软骨组织，其内含有大量的血管，是鹿茸血管发生最旺盛的部位。以该部位的软骨组织为样品，对细胞类成分和细胞外基质分别进行提取，进而进行活性蛋白质筛选及蛋白质组学分析，对于认识鹿茸血管发生过程中发挥调节作用的功能蛋白质群，进而推动我国传统动物药的深入开发有积极意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种软骨组织中细胞类成分与细胞外基质类成分的分级处理方法，同时可以保持各组分的活性，以期解决活性研究及蛋白质组学分析中，细胞类成分和细胞外基质类成分的互相干扰问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为:根据细胞外基质具有较好的机械强度并且水溶性较差的情况，采用冰冻组织切片技术将软骨组织切成5_20μπι的组织片，然后依次用提取溶液、碱溶液对其中的细胞类成分进行提取。而后用超纯水彻底清洗细胞外基质中残留的细胞类成分，获得单纯的细胞外基质类成分。具体为:I)切片处理取新鲜动物软骨组织样品，用生理盐水清洗，去除血液残留。用冷冻切片机切成厚度为10-20 μ m的组织切片，将组织薄片置于-80°C下迅速冷冻，之后于室温下完全融化。重复上述冻融过程2_4次。2)分级处理将组织切片置于提取溶液中，Ig组织切片中加入提取溶液为4-10ml，在4_37°C搅拌l-5h，超声处理l_5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的提取溶液中。重复提取2-4次，合并提取液获得蛋白质组分A。将组织切片取出吸干水分后置于4-10ml清洗溶液中，4-37°C搅拌l_5h，超声处理l_5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新溶液中。重复提取2-4次，将组织切片取出吸干水分后，置于超纯水中，在4-37°C搅拌Ι-lOmin，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中重复操作2-4次。将组织切片取出吸干水分后获得基质类成分B。3)活性蛋白质冻干将组分A置于超滤离心管中(截留分子量为3-10kD)，在500-5000r/min范围内离心30min_6h。向浓缩液中加入4_10ml超纯水,在500-5000r/min范围内离心30min_6h ;重复操作2-4次后，取出浓缩液冻干后，获得蛋白质组分A。将细胞外基质类成分B直接进行冻干处理。样品置于_80°C冰箱保存，待用。本专利技术的优点为:(I)组织切片法配合反复冻融处理可以实现细胞完全破碎；(2)多种溶剂提取可以全面获得细胞类成分，并去除细胞外基质上残留的细胞类蛋白质，实现较好的分级效果。本专利技术涉及，通过切片处理，可以将软骨组织切成厚度为5-20 μ m的切片，在此过程中软骨组织中的细胞多数被切割破裂。再经反复冻融处理后，细胞结构均被破坏。将组织切片置于4-37°C的提取溶液中，充分搅拌l_5h，超声处理l_5min，软骨组织中的细胞类成分会释放到提取溶液中。将组织片取出，获得的细胞类成分A。组分A可直接用于蛋白质组学分析，也可经透析后冻干处理，用于活性考察。将取出的组织片吸干水分后，再置于清洗溶液中，在4-37°C，充分搅拌l-5h，超声处理l_5min，彻底清除细胞类成分。将取出的组织切片吸干水分后，置于4-37°C的超纯水溶液中搅拌l-10min。将组织切片吸干水分后获得基质类成分B。用适当溶剂提取基质成分B中的蛋白质类物质，进行组学分析和活性实验。本专利技术的优点为:可以实现软骨组织中，细胞类成分和细胞外基质类成分的分离。相对于对软骨组织整体进行分析，本方法可以降低样品的复杂程度，减少细胞外基质类成分和细胞内成分之间的相互干扰，对于分别研究两者的活性及两者的蛋白质组成意义较大。【专利附图】【附图说明】图1为鹿茸软骨组织分级处理前后蛋白质组学分析结果框图。【具体实施方式】将动物软骨组织用生理盐水清洗，去除血液残留。采用冷冻切片机将软骨组织切成10 μ m厚的切片，将组织薄片置于-80°C下迅速冷冻，之后于室温下完全融化。重复上述冻融过程2-4次；将组织切片置于提取溶液中，Ig组织切片中加入提取溶液为4-10ml，在4_37°C搅拌l-5h，超声处理l_5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新的提取溶液中。重复提取2-4次，合并提取液置于超滤离心管中(截留分子量为3-10kD)，在500-5000r/min范围内离心30min_6h。向浓缩液中加入4-lOml超纯水，在500-5000r/min范围内离心30min_6h ；重复操作2-4次后，取出浓缩液冻干后，获得蛋白质组分A。将组织切片取出吸干水分后置于4-10ml清洗溶液中，4-37°C搅拌l_5h，超声处理l_5min，将组织切片取出吸干水分后，置于新溶液中。重复提取2-4次，将组织切片取出吸干水分后，置于超纯水中，在4-37°C搅拌Ι-lOmin，将组织切片取出吸干水分后，置于新的超纯水中重复操作2-4次。将组织切片取出吸干水分后冻干本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，随志刚，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：