含伴刀豆蛋白A的复合移植体,其制备方法及应用技术

本发明专利技术总地涉及组织工程学和再生医学，特别是涉及植物凝集素伴刀豆蛋白Ａ的体内诱导和促进哺乳动物软骨组织再生和修复活性。本发明专利技术进一步涉及基本上由伴刀豆蛋白Ａ和胶原蛋白组成的软骨组织修复移植体，其制备方法及其在治疗哺乳动物因各种原因导致的软骨组织损伤中的应用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总地涉及组织工程学和再生医学，特别是涉及含伴刀豆蛋白A的复合移植体，其制备方法及其在治疗因各种原因导致的软骨组织损伤中的应用。超过关节软骨生理耐受能力的撞击、剪切、扭曲和摩擦等外力均可导致关节软骨或其它永久软骨的机械损伤。由于成年哺乳动物的关节软骨缺乏直接血液、淋巴及神经供应，加之其代谢效率很低，所以成熟的关节软骨组织一旦受到损伤，将很难以自然修复。一般说来，软骨再生主要依赖于活的软骨细胞的存在。在软骨再生过程中，首先由相似于成纤维细胞的某些细胞增殖形成幼稚组织，然后由这些细胞分化成软骨母细胞并合成软骨基质。分化并增殖的细胞被埋入软骨隐窝内以形成静止的软骨细胞。另一方面，软骨细胞不仅自然修复十分缓慢，而且修复的组织还常常随时间的推移而发生退行性变化。因此，修复因创伤、炎症及各种退行性病变和先天性疾病等引起的关节软骨损伤，一直是组织工程学和再生医学领域里的一个难以解决的问题。近年来，随着关节镜技术在临床上的广泛应用和运动医学的发展，已相继出现并在临床上使用了许多关节软骨损伤的修复技术。例如，这些技术包括(1)人为损伤软骨下骨并暴露骨髓腔以促进软骨再生；(2)利用骨—软骨移植(包括自体和异体移植)技术修复软骨组织；(3)通过软骨膜或骨膜移植再生软骨组织；(4)局部应用生长因子(如IGF、bFGF、PDGF、TGF-β、HGF、CGF及BMP等)促进软骨组织原位再生和修复。组织工程学是二十世纪九十年代逐步建立并发展起来的一门综合学科。它应用工程学的基本原理和方法，预先在体外构建一个具有生物学活性的移植体，然后植入哺乳动物体内，以修复组织缺损，代替组织或器官的部分或全部功能，或作为一个体外装置，暂时替代器官的部分功能，达到延长包括人在内的哺乳动物生命，提高生存质量的目的。组织工程的基本要素是活的细胞、可供细胞完成生命周期的支架材料以及细胞与支架材料之间的相互作用。目前已开展的组织工程研究涉及软骨、骨、肌腱、肌肉、血管、皮肤、肝脏、胰脏、肾脏及血管等组织或器官。其中，软骨组织因细胞成分单一、支架材料来源充分，所以有关软骨组织修复及其代用品的研究在组织工程领域相对起步较早。利用组织工程技术修复软骨缺损的基本步骤包括体外培养并增殖少量所需的特异性组织细胞；将所得到的活细胞移植到预制备的基质材料中继续培养；待细胞与基质材料充分结合后，将所得到的结合体植入体内特定部位，以其代替受损组织或器官并在原位发挥这些组织或器官的功能。软骨细胞是目前软骨组织工程的主要细胞来源。可联合使用机械分离和酶(如胶原酶)消化方法从软骨组织中制备软骨细胞培养物。软骨细胞单层(二维)培养方法的缺陷在于多次传代细胞常常出现反分化现象。Benya等人(Benya and Shaffer，Cell 30373，1982)首次利用琼脂糖凝胶基质成功地完成了软骨细胞的三维培养。他们的研究还证明，在这种三维培养系统中，不仅可有效地保留体外培养的软骨细胞的固有表型，而且可使已出现反分化的细胞回复其高分化状态和细胞表型。此后，其它一些研究者也相继利用胶原蛋白凝胶(Yasui et al.，Exp.Cell Biol.5092，1982)和海藻糖凝胶(Hanselman et al.，J.Cell Sci.10717，1994)以及多聚2-羟乙基甲基丙烯酸盐含水凝胶(Reginate et al.，Arthritis.Rheum.37(9)1338，1994)培养得到了具有稳定表型和典型形态特征的软骨细胞或组织。为了克服三维培养系统存在的难以大量回收增殖细胞的问题，也已将微载体悬浮培养系统引入哺乳动物细胞的体外培养。研究证明，使用微载体悬浮培养技术，特别是使用II型胶原蛋白微载体培养软骨细胞，不仅可显着提高细胞增殖速度，而且可长时间保持细胞表型及生理功能(Freed et al.，Biomaterials 51257，1993；Frondoza et al.，Biomaterials 17879，1996)。在组织工程中，三维支架起到临时细胞外基质作用，为细胞提供附着、增殖、分化和代谢场所。更具体地说，在软骨组织工程中，软骨细胞以其所附着的三维支架为模板发生并形成新的软骨组织。软骨组织工程的支架材料可以是天然或合成来源的。其中纤维蛋白、胶原蛋白等天然生物材料是软骨组织工程研究中最常也是最早使用的支架材料。由于这些材料本身就是细胞外基质的组成成分，故具有良好的组织兼容性，并具有软骨细胞生长与分化状态良好和易于形成相应的软骨组织等优点。但由于材料来源的生物学差异性，而致使目前尚难以实现大批量生产。与天然材料相比，人工合成的材料具有可随意控制分子量、降解时间和疏水性，以及具有良好的组织兼容性等优点，所以也常被用作组织工程的支架材料。目前常用的合成材料包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酯(PGA)或它们的共聚物。自Chesterman等人首次利用体外培养的软骨细胞修复关节软骨缺损以来，一些研究者相继利用不同的基质材料和不同来源的软骨细胞进行软骨组织工程和软骨修复实验研究，已取得了某些成功的经验，并为进一步的深入研究和临床应用提供了有益的探索。颜炜群等人(Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.272(12)7833-7840，1997；Weiqun Yan et al.，J.Biol.Chem.265(17)10125-10131，1990)的研究发现，淋巴细胞有丝分裂原伴刀豆蛋白A(ConA)可抑制软骨细胞的DNA合成，并促进细胞高分子硫酸化蛋白糖(PG)、碱性磷酸酶(AKPase)和维生素D3受体的合成，及细胞外基质中钙的摄入和沉积。观察结果表明，ConA对体外培养的静止软骨细胞的成熟化和终末分化具有显着的特异性促进作用。然而，ConA对在体软骨细胞生长和软骨组织生长的生物学作用，迄今尚未见报导。本专利技术人在上述现有技术研究成果的基础上，制备了含淋巴细胞有丝分裂原伴刀豆蛋白A(ConA)的胶原蛋白凝胶，并以其作为修复哺乳动物软骨组织损伤的移植体。将所说的移植体植入哺乳动物关节内软骨组织损伤部位，观察4～20周后，结果令人惊奇地发现，不仅受损伤的软骨组织得以充分修复，而且再生的软骨组织在组织学和生理、生化特征上基本接近或相同于正常软骨组织，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术的一个目的是提供一种用于修复哺乳动物软骨组织损伤的移植体，特征在于所说的移植体基本上是由胶原蛋白基质和均匀地分散在所说基质中的凝集素组成的。根据本专利技术的一个优选实施案方案，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物、Lentil、WGA、PHA-L或PHA-P，以及UEA或它们的衍生物或片段。根据本专利技术的一个优选实施案方案，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物或片段。根据本专利技术的一个优选实施案方案，其中所说的伴刀豆蛋白A衍生物选自由一个、二个、四个、八个或十六个分子量为26KDa的亚单位构成的单体、二聚体、天然存在形式的四聚体、八聚体和十六聚体伴刀豆蛋白A，以及其一个或多个亚单位结构的侧链被选自琥珀酸、唾液酸的有机酸或选自烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、酯基、羧基或羟基的脂族或芳族基团取代的衍生物。根据本专利技术的一个优选实施案方案，其中所说的胶原蛋白是胶原蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于修复哺乳动物软骨组织损伤的移植体，特征在于所说的移植体基本上是由胶原蛋白基质和均匀地分散在所说基质中的凝集素组成的。

【技术特征摘要】
1，一种用于修复哺乳动物软骨组织损伤的移植体，特征在于所说的移植体基本上是由胶原蛋白基质和均匀地分散在所说基质中的凝集素组成的。2，根据权利要求1的移植体，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物、Lentil、WGA、PHA-L或PHA-P，以及UEA或它们的衍生物或片段。3，根据权利要求1的移植体，其中所说的植物凝集素是伴刀豆蛋白A或其衍生物或片段。4，根据权利要求1的移植体，其中所说的胶原蛋白是胶原蛋白I或II。5，根据权利要求1的移植体，其中所说的胶原蛋白是胶原蛋白II。6，根据权利要求1的移植体，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜炜群，陈昕，杨同书，侯立中，马昭若，胡春光，申鸣，
申请(专利权)人：吉林圣元科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]