制备组织工程骨的方法技术

本发明专利技术公开了制备组织工程骨的方法。所述方法包括：(1)将待诱导间充质干细胞进行预诱导处理，得到预诱导细胞；以及(2)将所述预诱导细胞与间充质干细胞进行混合，以便得到所述组织工程骨。利用本发明专利技术的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药领域。具体地，本专利技术涉及制备组织工程骨的方法。
技术介绍
骨损伤往往发生于外伤时骨折块穿出肢体或发生于开放性骨折清创时失活骨被清除，主要包括骨缺损和缺损修复两大部分。骨损伤是临床上的常见病，也是骨科治疗的难题之一。然而，目前适用于骨损伤疾病的药物仍有待开发。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出了制备组织工程骨的方法。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前，临床上常用的治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植和人工骨移植等，其中自体骨移植被认为是修复骨缺损的金标准。但是由于自体骨移植属于挖东墙补西墙，不仅提供的骨量十分有限，而且可能导致供区的创伤、畸形、疼痛及感染等问题，更重要的是造成了新的骨质缺损；异体骨来源有限，具有发生排斥反应及感染病毒性肝炎、艾滋病等传染病的风险；单纯人工骨移植由于缺少组织修复所必需的细胞，其成骨效能非常低。而且，对骨延迟愈合、骨不连的患者而言，上述方法往往效果不佳，手术后仍存在骨不连、骨延迟愈合的情况。专利技术人在对骨损伤疾病的治疗方法的研究中发现，基于干细胞具有高度自我更新能力、高度增殖和多向分化潜能、可植入性和重建能力等特性，可以在体外培养干细胞扩增后，输入骨损伤部位处，能够有效地治疗骨损伤疾病。专利技术人进行深入研究发现，通过对具有分化为骨细胞能力的间充质干细胞进行预诱导，能够得到具有较强的分化为骨细胞能力的预诱导细胞。进一步地，专利技术人发现，将间充质干细胞与预诱导细胞共同作用于骨损伤部位，骨损伤部位的修复及愈合效率明显高于预诱导细胞单独作用。由此，包含间充质干细胞及预诱导细胞的组织工程骨具有较强的增殖、分化为骨细胞的能力，能够使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。为此，本专利技术提出了一种制备组织工程骨的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)将待诱导间充质干细胞进行预诱导，得到预诱导细胞；以及(2)将所述预诱导细胞与间充质干细胞进行混合，以便得到所述组织工程骨。专利技术人发现，间充质干细胞具有分化为骨细胞的能力，但是分化方向不可控。进而，通过对其进行预诱导，得到具有较强分化为骨细胞能力的预诱导细胞，由此，预诱导细胞能够有效地分化为骨细胞，骨细胞得率较高。专利技术人意外地发现，将预诱导细胞和间充质干细胞共同作用时，骨细胞得率高于预诱导细胞单独作用。经深入研究发现，间充质干细胞不仅能够分化为骨细胞，提高骨细胞的数量，而且间充质干细胞分化过程中会产生一些促进因子，从而能够促进预诱导细胞的增殖和分化，整体上提高了骨细胞得率。由此，根据本专利技术实施例的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。根据本专利技术的实施例，上述制备组织工程骨的方法还可以具有下列附加技术特征：根据本专利技术的实施例，所述间充质干细胞的含量为1×107～1×108个/mL，所述预诱导细胞的含量为1×107～1×108个/mL。由此，所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。根据本专利技术的实施例，所述间充质干细胞与预诱导细胞的数量比为1:1～4，优选1:2。专利技术人经过大量实验得到上述比例关系，由此，所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。若间充质干细胞过多，将导致分化成的骨细胞得率偏低；若间充质干细胞过少，分化成的骨细胞得率同样偏低。根据本专利技术的实施例，所述间充质干细胞和所述待诱导间充质干细胞分别独立地为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、羊水干细胞或牙髓干细胞，优选脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞容易获得。由此，根据本专利技术实施例的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。本领域技术人员能够理解的是，脐带间充质干细胞是由脐带来源的细胞分离培养并纯化而来的，可通过市售获得。同理地，对骨髓间充质干细胞、羊水干细胞或牙髓干细胞的来源不再赘述。根据本专利技术的实施例，所述预诱导时间为6～8天，优选7天。专利技术人发现，诱导培养6～8天，诱导所需的细胞适合移植，若时间过长，细胞过度分化甚至死亡。根据本专利技术的实施例，步骤(2)进一步包括：将富血小板血浆、水凝胶以及三(2-二甲氨基乙基)胺的至少一种、所述间充质干细胞及所述预诱导细胞进行混合，并将所得到的混合细胞重悬于生理盐水中，以便得到所述组织工程骨。富血小板血浆中有多种生长因子，各生长因子的比例与人体内正常比例相符，使生长因子之间有最佳的协同作用，并且富血小板血浆中含有大量纤维蛋白，为修复细胞提供良好的支架。水凝胶的添加能够促进损伤细胞的粘附，加快愈合。三(2-二甲氨基乙基)胺可以加快细胞成骨分化。由此，根据本专利技术实施例的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。根据本专利技术的实施例，富血小板血浆浓度为2×1010个/mL；水凝胶浓度为1％w/v；三(2-二甲氨基乙基)胺浓度为100μM。专利技术人经过大量实验得到上述最优浓度，在此条件下所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。根据本专利技术的实施例，所述预诱导包括：将所述待预诱导间充质干细胞与扩增培养基接触，进行扩增培养，以便得到扩增培养产物；以及将所述扩增培养产物与预诱导培养基接触，进行预诱导培养，以便得到所述预诱导细胞。由此，根据本专利技术实施例的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。根据本专利技术的实施例，将所述扩增培养产物与预诱导培养基接触是将所述扩增培养产物按照3×103～8×103个/cm2，优选5×103个/cm2的接种量接种于所述预诱导培养基中。专利技术人经过大量实验得到上述最优接种量，在此条件下能够满足细胞增殖需求。根据本专利技术的实施例，所述扩增培养基包括：含10体积％胎牛血清的α-MEM培养液。专利技术人发现，利用包括含10体积％胎牛血清的α-MEM培养液的培养基进行培养，能够有效地使间充质干细胞增殖，便于后续的预诱导处理。需要说明的是，“α-MEM培养液”是本领域技术人员所公知的，对获得方式不作严格限定，例如自行配制、市售获得。根据本专利技术的实施例，α-MEM培养液购自Gibco，型号为12561-056。根据本专利技术的实施例，所述预诱导培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备组织工程骨的方法，其特征在于，包括：(1)将待诱导间充质干细胞进行预诱导，得到预诱导细胞；以及(2)将所述预诱导细胞与间充质干细胞进行混合，以便得到所述组织工程骨。

【技术特征摘要】
1.一种制备组织工程骨的方法，其特征在于，包括：(1)将待诱导间充质干细胞进行预诱导，得到预诱导细胞；以及(2)将所述预诱导细胞与间充质干细胞进行混合，以便得到所述组织工程骨。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的含量为1×107～1×108个/mL，所述预诱导细胞的含量为1×107～1×108个/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞与预诱导细胞的数量比为1:1～4，优选1:2。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞和所述待诱导间充质干细胞分别独立地为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、羊水干细胞或牙髓干细胞，优选脐带间充质干细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预诱导时间为6～8天，优选7天。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：将富血小板血浆、水凝胶以及三(2-二甲氨基乙基)胺的至少一种、所述间充质干细胞及所述预诱导细胞进行混合，并将所得到的混合细胞重悬于生理盐水中，以便得到所述组织工程骨。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，王思涵，张静，岳文，南雪，姚海雷，贾雅丽，房芳，
申请(专利权)人：华南生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44