本发明专利技术公开了一种以亮氨酸脱氢酶为生物催化剂制备单一光学纯L-叔亮氨酸的工艺方法，具体包括以下步骤：在反应液中加入底物三甲基丙酮酸、甲酸铵、亮氨酸脱氢酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡或搅动，反应后加热反应体系，过滤或离心除去变性蛋白，除去溶剂，过滤后，得到L-叔亮氨酸产物和含有少量L-叔亮氨酸的滤液，滤液循环用于下一轮反应，反应温度为15~50℃。本发明专利技术利用亮氨酸脱氢酶，配合辅酶循环再生体系，采用循环工艺制备L-叔亮氨酸，底物浓度高达2.0M，所需的辅酶NAD+或NADH浓度较低，并且可循环多次使用而达到忽略辅酶成本的水平，具有重要应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于手性医药中间体制备领域，涉及一种生物催化法不对称制备手性医药中间体的方法，具体涉及一种以三甲基丙酮酸为底物，以亮氨酸脱氢酶为生物催化剂，实现单一光学纯度的L-叔亮氨酸高效制备的工艺方法。
技术介绍
L-叔売氨酸，即L-2-氨基_3，3_二甲基丁酸,分子式为C6H13NO2,分子量为131. 17,CAS号为20859-02-3。L-叔亮氨酸是一种非蛋白源的手性氨基酸，由于疏水性叔丁基侧链具有较大空间位阻，在化合物的合成中它能够很好地控制分子构象，因此，该氨基酸作为一种重要的医药中间体，被广泛用于合成生物抑制剂、生物活性肽、抗癌和抗病毒等药物，例如百时美-施贵宝公司2009年销售额就达到14亿美金的抗HIV药物阿扎他韦；以L-叔亮氨酸作为医药中间体合成的抗丙型肝炎病毒药物博赛普韦、特拉普韦，已经完成了临床研究并于2011年上市；另一些从L-叔亮氨酸合成的抗丙型肝炎病毒药物BI201335，narlaprevir, vaniprevir以及BMS791325,也都进入了二期临床研究。因此，预计今后医药行业对L-叔亮氨酸的需求量将呈现逐年上升的趋势。传统的合成医药中间体L-叔亮氨酸的方法为化学方法，包括化学拆分法和化学不对称合成法。前者利用手性拆分试剂对外消旋体进行拆分，例如专利号为200710044378的中国专利技术专利采用光学纯酸性拆分剂拆分消旋叔亮酰胺获得光学纯度的叔亮氨酸，但最大收率不超过50% (参见Chem. Pharm. Bull. 1989，37，280-283);不对称合成法则可以直接合成L-叔亮氨酸，如Corey等利用叔丁基三氯甲基酮合成L-叔亮氨酸，得率近80%。但是，不对称合成存在诸多不足反应过程复杂、反应条件苛刻(_78°C)、生产成本高，并且在生产过程中需要用到多种有毒试剂，环境污染严重(参见J. Am. Chem. Soc. 1992，114， 1906-1908)。由于生物催化技术具有很强的底物专一性、较高的催化效率、温和的反应条件以及对环境污染较小等优点，已被广泛用于制备L-叔亮氨酸。通过生物催化合成L-叔亮氨酸主要包括两大类方法，即利用酶拆分光学活性叔亮氨酸以制备L-叔亮氨酸的方法和生物催化直接合成L-叔亮氨酸的方法。例如专利号为200610020854的中国专利技术专利利用米曲霉氨基酰化酶以及中国专利201010138158利用一种双酶体系(酰化氨基酸消旋酶和水解酶)都能拆分叔亮氨酸消旋体，制备高光学纯度的L-叔亮氨酸(光学纯度达99%ee值以上)。虽然这两种方法的生产成本适中，便于工业化生产，整个生产过程也较简单，但是，L-叔亮氨酸的理论得率低于50%。利用生物催化手段直接合成L-叔亮氨酸的方法，能提高L-叔亮氨酸的得率，如欧洲专利EP0726891B1用合适的酶(酯酶，脂肪酶或蛋白酶)催化底物azlactones合成目标产物L-叔亮氨酸以及美国专利US6197558B1利用转氨酶催化合成L-叔亮氨酸的方法。但是，这些方法操作步骤较多，工序繁琐，过程中需要用到较多有机溶剂，生产成本较高，并造成环境污染。Bommarius等报道了甲酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的偶联系统，利用甲酸脱氢酶为亮氨酸脱氢酶提供必要的还原型辅酶NADH，合成L-叔亮氨酸(参见Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851-2888 ； Org. Process Res. Dev. 2000,4，286 290)。然而，该方法受到底物浓度低，辅酶投入量大以及生产过程复杂导致成本过高等因素的制约。Esaki等用含有亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞催化剂对α酮羧酸进行还原转氨合成L-叔亮氨酸(参见Appli. Environm. Microbiology 1997, 63,4651-4656)。该方法虽然能够避免外加辅酶，但是用此种全细胞催化剂进行反应时，终产物的最大浓度约为0. 3M，难以进行工业化应用。中国专利CN1934264也采用类似的全细胞催化剂转化酮羧酸为L-叔亮氨酸，其优选的最大稳定底物浓度小于0. 4M，由于其产物浓度仍然较低，不利于工业化生产。Kula等用经分离后的亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶偶联催化底物三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸(参见J. Biotechnol. 1997，53，29-39)。虽然该方法能将底物的浓度提高到O. 5 1M，但L-叔亮氨酸的产率只有85%，并且该反应需要投入大量外加辅酶(2mM NAD+)，导致生产成本过高，同样限制了它在工业上的应用。因此，建立一种高效制备L-叔亮氨酸的生物催化工艺以提高底物浓度、减少辅酶投入和简化生产流程，对降低生产成本具有广泛的实用价值和重要意义。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种制备L-叔亮氨酸的方法，在保证高立体选择性、高转化率和高得率的基础上，有效提高底物浓度，减少辅酶投入，简化生产工艺和降低生产成本。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是一种制备L-叔亮氨酸的方法，包括以下步骤 (1)向反应液中加入底物三甲基丙酮酸、共底物甲酸铵、亮氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系； 所述反应液为水或PH7. (ΓΙΟ. O的缓冲液；底物浓度为I. 0M^2. OM ;所述共底物甲酸铵和底物三甲基丙酮酸的摩尔比为I :广10 I ;所述亮氨酸脱氢酶的浓度大于或等于2U/mL，亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比为I : Γ1 5;所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD+或NADH的浓度大于或等于O. OlmM (O. 007g/L)； (2)步骤(I)所得反应体系在振荡或搅拌条件下，调节反应体系pH至7.(Γ10. 0，于15飞O 1下，反应制备L-叔亮氨酸。上述技术方案中，步骤⑴中，所述底物三甲基丙酮酸的结构式为权利要求1.一种制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)向反应液中加入底物三甲基丙酮酸、共底物甲酸铵、亮氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系； 所述反应液为水或PH7. (ΓΙΟ. O的缓冲液；底物浓度为I. 0M^2. OM ;所述共底物甲酸铵和底物三甲基丙酮酸的摩尔比为I :广10 I ;所述亮氨酸脱氢酶的浓度大于或等于2U/mL，亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比为I : Γ1 5;所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD+或NADH的浓度大于或等于O. OlmM ； (2)步骤(I)所得反应体系在振荡或搅拌条件下，调节反应体系pH至7.(Γ10. 0，于15飞O 1下，反应制备L-叔亮氨酸。2.根据权利要求I所述制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，在保持反应进行的同时，补加底物三甲基丙酮酸；补加底物的方式选自一次性加入底物或分批加入底物或连续加入底物中的一种；并且保持反应体系中的底物浓度小于或等于2. 0Μ。3.根据权利要求I所述制备L-叔亮氨酸的方法，其特征在于，所述制备L-叔亮氨酸的方法还包括步骤(2)反应完成后将反应液于5(T100 °C下加热，使蛋白变性，离心或过滤除去变性蛋白，除溶剂后，经过滤，得到L-叔亮氨酸产物和含有少量L-叔亮氨酸的滤液。4.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备L？叔亮氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)？向反应液中加入底物三甲基丙酮酸、共底物甲酸铵、亮氨酸脱氢酶以及由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，配制得到反应体系；所述反应液为水或pH7.0~10.0的缓冲液；底物浓度为1.0M~2.0M；所述共底物甲酸铵和底物三甲基丙酮酸的摩尔比为1∶1~10∶1；所述亮氨酸脱氢酶的浓度大于或等于2U/mL，亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶摩尔比为1∶1~1∶5；所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系中NAD+或NADH的浓度大于或等于0.01mM；(2)步骤(1)所得反应体系在振荡或搅拌条件下，调节反应体系pH至7.0~10.0，于15~50？℃下，反应制备L？叔亮氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈依军，江金鹏，吴旭日，
申请(专利权)人：陈依军，
类型：发明
国别省市：
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