本发明专利技术适用于生物工程技术领域，提供了一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤：配制液体培养基；将菌种种龄为2.5-3.5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为2.5-7.0％(v/v)接种于所述液体培养基，在pH为3.5-4.5、通气量为0.4-1.0vvm、温度为28-34℃条件下，发酵培养22-26小时。本发明专利技术酵母工程菌发酵方法，通过对发酵培养基优化，对接种量、通气量、pH以及发酵过程其它参数进行修正改进，实现了发酵产物(美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05)发酵产量显著提升。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种酵母工程菌发酵方法和应用。
技术介绍
近年来，抗生素滥用各种弊端逐渐显现，抗菌肽(特别是美洲商陆抗菌肽)和抗生素具有相似的功用，其杀菌机理独特，抗菌谱范围广泛，对抗生素耐药菌、肿瘤细胞及病毒等均有良好的杀伤作用，且其本身毒副作用极低。但是，目前以发酵方法生产抗菌肽的产量不高，如《Novel Expression Vector for Secretion of Cecropin AD in Bacillus subtilis with Enhanced Antimicrobial Activity》一文中获得的抗菌肽含量为 30. 6mg/ L，《复合抗菌肽PL在毕赤酵母中的分泌表达及其活性研究》一文中两种抗菌肽的含量分别为95. 04mg/L和91mg/L，造成发酵生产抗菌肽成本相对较高，因此目前国内外开发的发酵法生产抗菌肽的工艺多停留在实验室阶段，无法进行工业化生产，本专利技术正是针对这一问题，以美洲商陆酵母工程菌为生产菌株，通过对发酵培养基优化，对接种量、通气量、PH以及发酵过程其它参数进行修正改进，使得抗菌肽产量大幅度提升，为实现抗菌肽的大规模生产开辟可行的路径。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例的目的在于提供一种产量高的酵母工程菌发酵方法。本专利技术是这样实现的，一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤配制包括如下组分的液体培养基；将菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为2. 5-7.0% (ν/ν)接种于该液体培养基，在ρΗ为3. 5-4. 5、通气量为0. 4-1. Ovvm、温度为条件下，发酵培养22-26小时，该培养基组分如下葡萄糖40_60g/L黄豆粉10-16. 8g/L玉米浆6-10g/L硫酸铵9_15g/L棉籽粉4_7.2g/L无水碳酸钙0.1-0. 3g/L磷酸二氢钾0.5_0.94g/L硫酸锌0.08-0.2g/L无水硫酸镁 0. 5-lg/L。本专利技术实施例进一步提供上述酵母工程菌发酵方法所制备的抗菌肽在药品、消毒产品中的应用。3本专利技术实施例酵母工程菌发酵方法，通过采用上述发酵培养基成分及含量、发酵 PH值、通气量等参数，实现了发酵产物(美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05)发酵产量显著提升。附图说明图1是本专利技术实施例发酵方法发酵过程中抗菌肽浓度、葡萄糖浓度及酵母工程菌数量变化图。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤SOl，配制包括如下组分的液体培养基；S02,将菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为 2. 5-7.0% (ν/ν)接种于该液体培养基，在ρΗ为3. 5-4. 5、通气量为0.4-1. Ovvm、温度为条件下，发酵培养22-26小时，该培养基组分如下葡萄糖40-60g/L黄豆粉10-16. 8g/L玉米浆6-10g/L硫酸铵9-15g/L棉籽粉4-7. 2g/L无水碳5睃钙0. l-o. 3g/L磷酸二氢钾0. 5-0. 94g/L硫酸锌0. 08-0. 2g/L无水硫5睃镁0. 5-lg/Lo具体地，该美洲商陆酵母工程菌是指包含有美洲商陆抗菌肽基因序列Ι^-ΑΜΡ05的酵母工程菌，具体是指申请号201010278464. O的专利中的酵母工程菌。该专利文件中， 关于酵母工程菌的表述为一种酵母工程菌，该酵母工程菌包含由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽I^-AMP05 基因重组构成的重组质粒，美洲商陆抗菌肽 ^_ΑΜΡ05基因序列如SEQ ID NO=I所示。本专利技术实施例的酵母工程菌中，重组质粒由酵母穿梭质粒和美洲商陆抗菌肽 Pa-AMP05基因重组而成，该重组质粒在酵母细胞基因组之外，游离于酵母细胞质之中。酵母穿梭质粒是美洲商陆抗菌肽 ^_ΑΜΡ05基因的表达载体。将酵母工程菌扩大培养，其基因组得到表达，同时本专利技术实施例的酵母工程菌中的重组质粒也得到表达。本专利技术实施例中的酵母，包括各种酵母，例如毕赤酵母、酿酒酵母，优选的为酿酒酵母，其中酿酒酵母，包括但不限于酒精酵母、汉逊酵母、假丝酵母等，优选的为酿酒酵母 S78。酿酒酵母含有符合机体需求的优质蛋白、膳食纤维、复合维生素B和有机铬、锌、硒、 铁、钙等元素，其本身即是一种纯天然、无污染、生物态的健康营养源。酿酒酵母是食品级的表达系统，其表达产物安全无毒，使得本专利技术实施例的酵母工程菌的表达产物中不会掺杂有害物质。同时酵母遗传背景清楚，适用于工业化生产。本专利技术实施例对酵母穿梭质粒没有具体的限制，可以为各种酵母穿梭质粒，只要能够在酵母细胞中作为表达载体即可，包括含有诱导型启动子的酵母穿梭质粒，还包括含有非诱导型启动子的酵母穿梭质粒，这些酵母穿梭质粒都能够作为美洲商陆抗菌肽 Pa-AMP05基因的表达载体，使得美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05基因在酿酒酵母中能够得到表达。诱导型启动子，在基因表达中，需要加入诱导剂才能启动基因的表达，非诱导型的启动子即在基因表达中不需要加入诱导剂，基因也能够得到表达。例如酵母穿梭质粒PYES2，以半乳糖为诱导剂；酵母穿梭质粒PYES6/CT，也以半乳糖为诱导剂以及酵母穿梭质粒ρ (212 等。非诱导型启动子优选的为酵母穿梭质粒pVT102U/ci。酵母穿梭质粒pVT102U/a含有非诱导型启动子，使得上述重组质粒在表达过程中，不需要加入任何的诱导剂，避免了表达产物中混入诱导剂杂质，例如甲醇，保证了表达产物的安全。本酵母穿梭质粒pVT102U/a 是分泌型表达载体，通过α因子的信号肽的作用，能够将表达产物分泌到酵母细胞外，也简化了表达产物分离提纯的过程，节约成本。另外，请参见图2，图2显示以酵母穿梭质粒pVT102U/ci作为美洲商陆抗菌肽 Pa-AMP05基因的表达载体时，重组质粒所具有的表达框 ADHl-α -MFL-抗菌肽 Pa-AMP05_TT其中ADHl为启动子，α -MFL为α因子信号肽的碱基序列，TT是终止子，抗菌肽 Ι^-ΑΜΡ05是指美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05的碱基序列，具体见于SEQ ID Ν0:1。美洲商陆抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05基因表达的抗菌肽蛋白Ι^-ΑΜΡ05的N端区域与α因子的信号肽融合，信号肽引导着整个融合蛋白分泌到酵母细胞外的培养基中；α因子的信号肽带有前体加工酶 Kex2的酶切位点，融合蛋白在酵母本身分泌的Kex2的作用下切掉信号肽而直接得到具有天然构象和生物活性的目标抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05蛋白。SEQ ID NO 1gctggttgtattaaaaatggtggtagatgtgttgcttctggtggtccaccatattgttgttctaattattgttBtBgBCBBgttggttgggCtCBtBgBtattgtBBBBBtBgBtBB。具体地，步骤SOl中，该液体培养基的组分如下葡萄糖40_60g/L，黄豆饼粉 10-16. 8g/L，玉米浆6-10g/L，硫酸铵9_15g/L，棉籽饼粉4-7. 2g/L，无水碳酸钙0. 1-0. 3g/ L,磷酸二氢本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤：配制包括如下组分的液体培养基；将菌种种龄为２．５－３．５亿个／ｍＬ的美洲商陆酵母工程菌按接种量为２．５－７．０％（ｖ／ｖ）接种于所述液体培养基，在ｐＨ为３．５－４．５、通气量为０．４－１．０ｖｖｍ、温度为２８－３４℃条件下，发酵培养２２－２６小时，所述培养基组分如下：葡萄糖 ４０－６０ｇ／Ｌ黄豆粉 １０－１６．８ｇ／Ｌ玉米浆 ６－１０ｇ／Ｌ硫酸铵 ９－１５ｇ／Ｌ棉籽粉４－７．２ｇ／Ｌ无水碳酸钙 ０．１－０．３ｇ／Ｌ磷酸二氢钾 ０．５－０．９４ｇ／Ｌ硫酸锌 ０．０８－０．２ｇ／Ｌ无水硫酸镁 ０．５－１ｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
1.一种酵母工程菌发酵方法，包括如下步骤 配制包括如下组分的液体培养基；将菌种种龄为2. 5-3. 5亿个/mL的美洲商陆酵母工程菌按接种量为2. 5-7. 0% (ν/ν) 接种于所述液体培养基，在PH为3. 5-4. 5、通气量为0. 4-1. Ovvm、温度为条件下，发酵培养22-26小时，所述培养基组分如下 葡萄糖40-60g/L黄豆粉10-16.8g/L玉米浆6-10g/L硫酸铵9-15g/L棉籽粉4-7. 2g/L无水碳酸钙 0. 1-0. 3g/L 磷酸二氢钾 0. 5-0. 94g/L 硫酸锌0. 08-0. 2g/L无水硫酸镁 0. 5-lg/L。2.如权利要求1所述的酵母工程菌发酵方法，其特征在于，所述液体培养基的组...
【专利技术属性】
技术研发人员：董清风，张捷，郑文官，彭永鹤，
申请(专利权)人：深圳市圣西马生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：94
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