【技术实现步骤摘要】
基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法
本专利技术涉及生物技术检测领域,具体涉及一种基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法。
技术介绍
能量代谢维持着生命体最基本的生命活动,比如植物逆境和动物疾病通常伴随着严重的代谢紊乱,且大多归咎于能量代谢紊乱。能量代谢也影响着免疫细胞的功能和命运,与抗病和免疫应答有关。同时,蛋白质磷酸化的修饰基团来自于ATP,所以能量代谢异常可进一步导致上游蛋白质磷酸化通路的改变,严重影响生物体的各项生理、病理功能。生物体内的能量代谢过程主要包括三羧酸循环、糖酵解途径和氧化磷酸化过程。三羧酸循环(tricarboxylicacidcycle),又称为柠檬酸循环或TCA循环或Krebs循环,是需氧生物体内普遍存在的代谢途径,分布在线粒体中;是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路;又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。糖酵解途径(glycolyticpathway)又称EMP途径,是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应,是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径。EMP途径为生物体提供一定的能量,其中间产物为生物合成提供原料。氧化磷酸化过程,存在于真核细胞的线粒体或细菌中,是物质在体内氧化时释放的能量供给ADP与无机磷合成ATP的偶联反应。因此,能够全面直观的分析多种生物样本种与能量代谢通路相关代谢物含量,对研究与能量代谢紊乱相关疾病的生理、病理具有积极的指导意义。目前能量代谢通路的关键物质的分析策略主要有三种,一种是对待测样品进行衍生 ...
【技术保护点】
1.基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法,其特征在于,包括如下步骤:/n步骤S1构建标准曲线,分别称取能量代谢物标准品,再使用50%乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液,标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线;/n步骤S2样品制备,取待测组织样本,加水制成组织匀浆,再加入甲醇/乙腈混合液,涡旋混合,冰浴中超声波处理,再孵育沉淀蛋白,高速离心取上清液,真空干燥,备用;/n步骤S3液相色谱分析,取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品,离心取上清进行液相色谱分析,色谱条件如下:/n4℃进样,柱温45℃,流速为300μL/min;液相梯度如下:0-12min,B液从95%线性变化到76%;12-12.1min,B液从76%线性变化到47%;12.1-15.1min,B液从47%线性变化到95%,15.1-22min,B液维持在95%;/n步骤S4质谱分析,步骤S3中色谱分离的样品直接进入质谱分析,质谱条件是,采用ESI源,离子源温度:450℃;雾化气压:45;辅助气压:45;气帘气:30;喷雾电压:-4500V,采用多反应监测模式检测。/n
【技术特征摘要】
1.基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤S1构建标准曲线,分别称取能量代谢物标准品,再使用50%乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液,标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线;
步骤S2样品制备,取待测组织样本,加水制成组织匀浆,再加入甲醇/乙腈混合液,涡旋混合,冰浴中超声波处理,再孵育沉淀蛋白,高速离心取上清液,真空干燥,备用;
步骤S3液相色谱分析,取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品,离心取上清进行液相色谱分析,色谱条件如下:
4℃进样,柱温45℃,流速为300μL/min;液相梯度如下:0-12min,B液从95%线性变化到76%;12-12.1min,B液从76%线性变化到47%;12.1-15.1min,B液从47%线性变化到95%,15.1-22min,B液维持在95%;
步骤S4质谱分析,步骤S3中色谱分离的样品直接进入质谱分析,质谱条件是,采用ESI源,离子源温度:450℃;雾化气压:45;辅助气压:45;气帘气:30;喷雾电压:-4500V,采用多反应监测模式检测。
2.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法,其特征在于,所述的步骤S1中的系列梯度浓度范围是1-50000ng/mL;所述的能量代谢物标准品包括乌头酸、二磷酸腺苷、α-酮戊二酸、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、柠檬酸、环腺苷酸、黄素单核苷酸、延胡索酸、5'-二磷酸鸟苷、5'-鸟苷酸、5'-三磷酸鸟苷、异柠檬酸、苹果酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、琥珀酸和磷酸三苯酯。
3.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法,其特征在于,所述的步骤S2中的水和甲醇/乙腈混合液先预冷至温度为4℃,所述的水为超纯水,所述的甲醇/乙腈混合液为体积比1:1的混合液,所述的超声波处理为350W处理20min,所述的孵育沉淀蛋白是-20℃孵育1h。
4.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法,其特征在于,所述的步骤S2和步骤S3的离心是14000rcf4℃离心15min。
5.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法,其特征在于,所述的步骤S3中的使用50%的乙腈复溶干燥样品;所述的步骤S3中的A液为10mM的乙酸铵水溶液,pH9.2;所述的B液是10mM乙酸铵水溶液溶于85%乙腈水溶液,pH9.2。
6.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法,其特征在于,所述的步骤S4中质谱分析的代谢物定量离子对、定性离子对,及其相应的碰撞能信息如下:
...
【专利技术属性】
技术研发人员:张惠萍,刘泰驿,
申请(专利权)人:上海中科新生命生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:上海;31
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